目的

对荷瘤小鼠非淋巴组织开展多参数流式细胞术，可实现免疫细胞组成、表型及功能的表征、分离与检测。本文介绍一种非淋巴组织处理方法，采用一套基础抗体组合，可在单管染色条件下区分全部主要免疫细胞类群。该抗体组合可用于肿瘤相关巨噬细胞的表型分析。

背景

实体肿瘤由肿瘤细胞（恶性上皮或者间充质来源）和肿瘤微环境基质细胞两大主体组成。后者主要由免疫浸润细胞和基质结构细胞构成。免疫浸润细胞包含肿瘤相关巨噬细胞（TAM），T淋巴细胞，NK细胞，树突状细胞DC，中性粒细胞，肥大细胞，髓系来源抑制细胞（MDSC）和嗜酸性粒细胞 。基质结构细胞包含癌相关成纤维细胞CAF，内皮细胞和周细胞。巨噬细胞是肿瘤中占比最高的免疫浸润细胞 [1]，占比高达50%。它们调控肿瘤微环境的多个环节，参与肿瘤的生长与进展 [2]。大量研究证实，在多种肿瘤中，巨噬细胞的数量与细胞多样性和肿瘤进展呈正相关 [3]。因此，识别并解析肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的功能，对理解肿瘤发病机制、开发新型治疗手段至关重要 [4‑6]。由于同一肿瘤内部的TAM存在显著的表型与功能异质性，且不同肿瘤类型具备各自特征，过去对其表型界定一直存在难度 [7]。TAMs并非巨噬细胞的经典亚群，因为这些细胞在生理稳态条件下无法观察到，而是与特定的病理状态（如炎症和肿瘤）相关。TAMs在肿瘤微环境（TME）中并非单一功能的细胞，而是同时具备抗肿瘤活性和促肿瘤活性的两面性。通过直接吞噬肿瘤细胞，抗原呈递与免疫激活，分泌促炎因子和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等机制呈现M1样特性抗肿瘤。TAMs的两面性体现在——少数亚群具有抗肿瘤活性，但绝大多数TAMs在肿瘤微环境的驯化下倾向于促肿瘤方向。虽然TAMs具有可塑性，但在实体瘤微环境中，它们表现出明确的侧重性，即偏向M2样极化。TAMs的表型可随微环境变化而动态转变，这为靶向治疗提供了理论空间。过去数十年间，流式细胞术已成为免疫细胞快速鉴定与功能分析灵活且不可或缺的工具。本文基于多参数流式细胞术，建立一套组织处理方案，并介绍一套基础抗体组合，可同时解析小鼠肿瘤微环境内全部主要免疫细胞类群，并区分TAM不同亚群的表型 [7]。肿瘤制备得到的单细胞悬液可在单管样本中完成检测，能够对十余种免疫细胞开展相对定量，包括淋巴细胞、粒细胞以及单核吞噬细胞（单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。该抗体组合可对不同肿瘤类型中特征性TAMs进行表型分析。根据流式细胞仪检测通道配置，这套基础抗体组合还可进一步拓展，用于深入表征目标特定细胞亚群。

试剂

一.储备液

所有溶液均需用去离子水配制；且部分溶液需经无菌过滤。储备液可提前配制并储存；工作液需在实验当日现配现用。

1. 1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4：137 mM氯化钠、2.7 mM氯化钾、4.3 mM磷酸氢二钠、1.47 mM磷酸二氢钾，调pH至7.4，无菌过滤。

2. 不含钙、镁离子的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）：0.137 M氯化钠、5.4 mM氯化钾、0.25 mM磷酸氢二钠、1 g/L葡萄糖、0.44 mM磷酸二氢钾、4.2 mM碳酸氢钠，无菌过滤。

3. 1×ACK 红细胞裂解液：8.29 g氯化铵、1 g碳酸氢钾、37.2 mg乙二胺四乙酸二钠，溶于1 L去离子水，pH 7.2‑7.4，无菌过滤。

4. 120 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，无菌过滤。

5. 1 M 4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液，pH 7.4。

6. 台盼蓝拒染染色液。

7. 胶原酶 A，10 mg/mL，溶于 PBS。

8. DNase I（Ⅱ 级，牛胰腺来源），40×10³ Kunitz 单位 /mL。

9. 胎牛血清（FCS），热灭活处理。

10. 牛血清白蛋白（BSA），V 级。

11. 荧光活性染料。

12. 基础溶液：1×HBSS、5% 胎牛血清、10 mM HEPES；无菌过滤，4 ℃保存。

13. 重悬液：1×PBS中含1% BSA、5 mM EDTA、10 mM HEPES；无菌过滤，4 ℃保存。

14. 洗涤液：1×PBS中含3% 胎牛血清、10 mM EDTA、10 mM HEPES；无菌过滤，4 ℃保存。

15. 正常小鼠血清。

16. 正常大鼠血清。

17. 纯化大鼠抗小鼠CD32/CD16 抗体（Fc 封闭抗体），0.5 mg/mL。

18. 无甲醇16% 多聚甲醛。

二.工作液

1. 消化液：基础溶液中含有1.5 mg/mL胶原酶A、800 Kunitz单位/mL DNase I。

2. 封闭液：洗涤液中含有5%正常小鼠血清、5%正常大鼠血清、5 μg/mL 抗‑CD32/CD16（Fc封闭抗体）。

3. 浓度0.4% 多聚甲醛（溶于PBS）。

步骤

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参考文献

1.Noy, R. & Pollard, J. W. Tumour‑associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity 41, 49–61 (2014).

2.Ruffell, B., Affara, N. I. & Coussens, L. M. Differential macrophage programming in the tumor microenvironment. Trends Immunol. 33, 119–126 (2012).

3.Qian, B. & Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell 141, 39–51 (2010).

4.Mantovani, A. et al. Tumour‑associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat. Rev. Clin. Oncol. 14, 399–416 (2017).

5.Williams, C. B., Yeh, E. S. & Soloff, A. C. Tumor‑associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer 2, 15025 (2016). 

6.Georgoudaki, A. M. et al. Reprogramming tumor‑associated macrophages by antibody targeting inhibits cancer progression and metastasis. Cell Rep. 15, 2000–2011 (2016).

7.Yu, Y‑R. A. et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non‑lymphoid tissues. PLoS ONE 11, e0150606 (2016).

8.Franklin, R. A. et al. The cellular and molecular origin of tumor‑associated macrophages. Science 344, 921–925 (2014).

9.Yu, Y. R. et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 54, 13–24 (2016).