目的

肾脏巨噬细胞是肾脏内数量最多的免疫细胞群，参与维持机体稳态、介导组织损伤与修复，并在免疫监视中发挥关键作用。肾脏巨噬细胞主要分为两大亚群：浸润性巨噬细胞与肾脏驻留巨噬细胞；其中浸润性巨噬细胞又可进一步分为Ly6C高表达（Ly6C^hi）和 Ly6C低表达（Ly6C^lo）两个细胞亚群。尽管近年研究已逐步阐明两类细胞的起源差异与微环境分布特征，但目前仍需更深入地解析肾脏巨噬细胞亚群特征，及其在不同病理生理条件下的应答模式。本Protocol详述一套高效分离小鼠肾脏巨噬细胞的实验方案，可用于后续流式细胞术检测分析。

背景

肾脏巨噬细胞群体主要由三类细胞构成：Ly6C高表达（Ly6C^hi）单核细胞来源的浸润性巨噬细胞、Ly6C低表达（Ly6C^lo）单核细胞来源的浸润性巨噬细胞，以及肾脏驻留巨噬细胞，其定位于管周毛细血管血管外侧，具有监测内皮物质转运的独特功能，可清除免疫复合物可诱发Ⅲ 型超敏反应[1]。生理稳态状态下，Ly6C高表达与 Ly6C低表达浸润性巨噬细胞仅少量迁入肾脏；但在炎症或组织损伤期间，二者的浸润水平会显著升高。

图1.The origins of macrophages in kidney [6].

Ly6C高表达巨噬细胞可在肾脏损伤后大量聚集，于免疫应答初期分泌促炎细胞因子，进而加重组织损伤。由Ly6C高表达巨噬细胞分化而来的 Ly6C低表达巨噬细胞具有促纤维化作用，可促进损伤修复与创面愈合。与上述浸润性细胞亚群不同，肾脏驻留巨噬细胞属于组织固有细胞，在胚胎发育阶段即定植于肾脏；其细胞群数量依靠原位增殖与骨髓来源 Ly6C^hi单核前体细胞的补充共同维持 [2,5]。该类细胞参与肾脏血管生成与器官发育、介导免疫监视，并在急性肾损伤后的组织修复过程中发挥重要作用。在小鼠肾脏中，巨噬细胞约占全部 CD45⁺免疫细胞总数的 50%[2]。肾脏巨噬细胞由胚胎起源与单核细胞起源两大类群共同组成，其中胚胎起源巨噬细胞为优势亚群。在胚胎第 8.5 天、E13.5 天、E18.5 天分别进行谱系标记后检测发现，胚胎来源巨噬细胞在肾脏总巨噬细胞中的占比依次为：7.27 ± 0.4%、46.7 ± 2.5%、98.8 ± 0.3%[2]。出生后，胚胎来源巨噬细胞主要依靠CX3CR1/CX3CL1 信号轴介导的原位自我更新实现稳态维持 [3]。作为肾脏驻留巨噬细胞（KRMs）的主体，胚胎起源巨噬细胞与单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）共同构成肾脏巨噬细胞体系，协同维持肾脏生理稳态。生理状态下，单核细胞来源巨噬细胞的占比会随年龄增长逐渐升高，成年后可达约 40%[2]。

早期研究主要依据CD11b与F4/80的表达差异，区分单核细胞来源巨噬细胞（MDM）与肾脏驻留巨噬细胞（KRM）：其中 MDM 为 CD11b^Hi、F4/80^Lo表型，KRM 为 CD11b^Lo、F4/80^Hi表型。后续研究进一步发现，CD64与C-C 趋化因子受体 2（CCR2） 可分别作为鉴别肾脏驻留巨噬细胞与单核细胞来源巨噬细胞的补充标志物。

科研人员进一步完善了肾脏巨噬细胞亚群的细分标准。例如，有学者根据CX3CR1与CD81的表达情况，将肾脏巨噬细胞划分为三个独立亚群：CX3CR1^- CD81^-、CX3CR1^+ CD81^-以及 CX3CR1^+ CD81^+。

小鼠肾脏包含约16000个功能单位（即肾单位），与人类肾脏功能类似，在调节血压、全身含水量、电解质平衡及红细胞数量方面发挥关键作用。肾脏不同解剖区域的微环境差异极大，且会随机体生理需求动态变化：位于肾髓质的巨噬细胞越靠近肾盂，所处环境渗透压越高；尿路感染发生后，该类细胞还会直接暴露于细菌环境中。反观肾皮质巨噬细胞，通常不会接触病原菌，且长期处于正常渗透压环境。当使用巨噬细胞清除剂ClodronateLiposomes&ControlLiposomes套装（Cat#：C283539）清除肾脏巨噬细胞时，如果做免疫荧光检测，需要考虑肾脏的自发荧光，设立好对照，区分肾皮质和肾髓皮，可参考图1。因此，高效分离并精准分析不同微环境中的肾脏巨噬细胞亚群，对阐明其在生理稳态及肾脏疾病中的作用至关重要。

图2：氯膦酸盐脂质体清除肾脏巨噬细胞，尾静脉注射，Day1，2连续注射2次，10ul/g，Day3取样检测

本Protocol实验方案详细介绍：在终末麻醉状态下经心脏灌流摘取小鼠肾脏、组织处理、单细胞制备，最终通过流式细胞术开展检测分析的完整流程。实验第1天仅进行器械与试剂准备工作；第2天开展动物处死与肾脏取材。本方案选用阿佛丁（2,2,2 - 三溴乙醇） 作为麻醉剂，已有研究证实异氟烷会干扰免疫细胞亚群稳态 [4]。

小鼠完全麻醉后，打开腹腔与胸腔，实施心脏灌流。灌流操作可最大程度避免外周血免疫细胞（如单核细胞）污染肾脏原代细胞样本。肾脏组织经充分剪碎后，采用酶消化法制备单细胞悬液，依次进行70 μm滤网过滤、红细胞裂解，重悬于Fc封闭缓冲液中，再开展后续抗体染色。第2天全程操作时长约6小时；方案建议：若无法及时上机，可固定细胞，并在48小时内完成流式检测。如需即时检测，也可调整流程，抗体染色后直接上机分析。实验最后一日，将染色完成的样本上机流式检测，并完成数据分析。

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参考文献

1.Stamatiades, E. G., Tremblay, M. E., Bohm, M., Crozet, L., Bisht, K., Kao, D., Coelho, C., Fan, X., Yewdell, W. T., Davidson, A., Heeger, P. S., Diebold, S., Nimmerjahn, F., & Geissmann, F. (2016). Immune Monitoring of Trans-endothelial Transport by Kidney-Resident Macrophages. Cell, 166(4), 991–1003. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.058

2.Liu F, Dai S, Feng D, Qin Z, Peng X, Sakamuri S, et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. (2020) 11:2280. doi:  10.1038/s41467-020-16158-z

3.Yashchenko A, Bland SJ, Song CJ, Ahmed UKB, Sharp R, Darby IG, et al. Cx3cr1 controls kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. (2023) 14:1082078. doi:  10.3389/fimmu.2023.1082078

4.Choi JW, Shin BS (2018) Isoflurane decreases interleukin-2 production by increasing c-Cbl and Cbl-b expression in rat peripheral blood mononuclear cells. J Int Med Res 46(7): 2792–2802. https://doi.org/10.1177/ 0300060518770955

5.Munro DAD, Hughes J (2017) The origins and functions of tissue-resident macrophages in kidney development. Front Physiol 8:837. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00837

6.Li Z, Zimmerman KA, Yoder BK. Resident Macrophages in Cystic Kidney Disease. Kidney360. 2021;2(1):167-175. doi:10.34067/KID.0006052020