目的

巨噬细胞是白色脂肪组织中主要的白细胞群体之一，在白色脂肪组织稳态维持与组织重塑过程中发挥重要作用。白色脂肪组织中巨噬细胞的功能由其发育起源与局部组织微环境共同决定。本文介绍一种利用流式细胞术分析小鼠白色脂肪组织中不同巨噬细胞亚群的实验方案。

背景

脂肪组织是一个动态的器官，由储存脂质的脂肪细胞、脂肪细胞干细胞（ASCs）和驻留免疫细胞组成。巨噬细胞是脂肪组织中最丰富的免疫细胞之一，根据生理环境的不同，可以维持组织功能或引发炎症。白色脂肪组织（WAT）是一类异质性组织，不仅包含以脂质形式储存能量的脂肪细胞，还含有内皮细胞、成纤维细胞以及多种免疫细胞等其他细胞类型。白色脂肪组织可动态适应全身稳态变化以维持组织功能，例如在能量摄入过量及肥胖发生过程中均可发生适应性改变 [1]。白色脂肪组织的重塑过程由组织内多种细胞协同调控 [2]。巨噬细胞是白色脂肪组织中数量最多的白细胞亚群，在脂肪组织稳态维持与重塑过程中发挥关键作用 [3]。在正常瘦态生理条件下，基质细胞中有 5%~10% 为巨噬细胞 [4]。白色脂肪组织中巨噬细胞的功能由其发育起源与局部组织微环境共同决定。白色脂肪组织中同时存在卵黄囊来源的组织驻留巨噬细胞和骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞 [3,5]，二者分别调控脂肪组织的发育扩张以及饮食诱导的炎症反应 [6]。通过特异性表面标志物表达差异，可从小鼠成年白色脂肪组织中分离得到不同的巨噬细胞亚群（图 1）[6]。

研究可根据TIM4与CD11c的表达差异区分白色脂肪组织中的巨噬细胞亚群 [6]，结合MHCII的表达特征可进一步细分：主要分为两类卵黄囊来源的组织驻留巨噬细胞亚群（alpha、bata亚群）以及两类骨髓来源的单核/巨噬细胞亚群（gamma、delta亚群）。在饮食诱导肥胖引发脂肪组织炎症的状态下，骨髓来源单核细胞会大量募集至脂肪组织，导致白色脂肪组织中g/d亚群巨噬细胞数量显著增多 [6]。

图1. 脂肪组织驻留巨噬细胞亚群的模式图概述。 图中标明了可用于区分不同细胞群组的细胞表面标志物。这些巨噬细胞群体可分为四个亚群（α、β、δ、γ）[6]。

在白色脂肪组织（WAT）中，Svetoslav Chakarov研究团队确定了三种巨噬细胞群体[7]。它们具有不同的定位、周转和表型。通过整合转录组、蛋白质组和空间图谱分析，作者根据解剖位置鉴定了三种不同的脂肪组织巨噬细胞（ATM）亚群：

• 实质巨噬细胞（pATMs）：分散在脂肪细胞之间，低表达LYVE1和CD209b，可能对应于MHCII-hi ATM。

• 被膜巨噬细胞（cATMs）：集中在组织最外层的包膜中，高表达LYVE1但是不表达CD209b。

• 间隔巨噬细胞（sATMs）：以表达CD209b和LYVE1为特征，特异性地定位于分隔脂肪小叶的胶原和透明质酸丰富的间隔结构中。与单核来源的pATMs相比，sATMs具有胚胎起源、长期存留和低更新率的特点。

图2. 白色脂肪组织不同空间定位的巨噬细胞生态位。白色脂肪组织在解剖学上分为三个隔室——隔膜、包膜和实质——每个隔室中都含有各自独特的脂肪组织巨噬细胞（ATMs）群体[7]。

除了先前根据F4/80和CD11c或CD206标志物分类的促炎型（M1型）和替代活化型（M2型）巨噬细胞外，还报道了一些新类别的ATM亚群，如称为M3型ATM（CD11c⁻CD206⁻MGL1⁻）；代谢活化型巨噬细胞（MMe）；脂质相关巨噬细胞（LAM）和Duffy抗原趋化因子受体（DARC⁺ATM）等。具体见表1。

表1.新鉴定的脂肪组织巨噬细胞亚型。脂肪组织中ATM的可塑性。 在瘦型脂肪组织中，抗炎的M2样巨噬细胞占主导地位，维持组织稳态。在肥胖脂肪组织中，促炎的M1型ATM增多，围绕死亡脂肪细胞形成冠状结构（CLS）。近期研究已发现新的巨噬细胞亚型，尤其是在CLS中[8]。

小鼠动物体内实验时，如何使用Cell-Del®Clodronate Liposomes and Control Liposomes（C283539）氯膦酸盐脂质体清除脂肪巨噬细胞？需要综合考虑模型特点，脂肪巨噬细胞部位和实验设计目的等因素。如原位局部清除小鼠腹股沟白色脂肪组织中的巨噬细胞。建议局部多位点低剂量皮下注射。20-50μL/位点/次；慢性模型还需要多次注射。氯膦酸盐脂质体注射后，可使用QPCR和/或流式细胞术检测巨噬细胞标志基因F4/80的表达。附睾脂肪组织中的F4/80表达及外周血单核细胞数量均未受局部注射氯膦酸盐脂质体的影响，表明该清除作用局限于小鼠腹股沟白色脂肪组织局部，不会系统性扩散。

当清除附睾脂肪组织巨噬细胞，如高脂诱导的肥胖模型，模型诱导所需时间长，就需要多次注射，建议麻醉小鼠而无需手术切口直接原位注射到附睾脂肪组织，每3天一次，125-150μL/次/侧，免疫荧光和/或流式细胞术检测清除效果。

巨噬细胞高度异质性和具有可塑性。如何能够有效分离，分群和鉴定巨噬细胞，对评价氯膦酸盐脂质体清除效果和研究巨噬细胞功能，就显得尤为关键和重要。本Protocol详细介绍利用流式细胞术分离并检测白色脂肪组织巨噬细胞的实验方法。

试剂准备：

1. 1× Dulbecco‘s磷酸盐缓冲液（DPBS），不含钙和镁。

2. FACS缓冲液：含0.5%（w/v）BSA、2 mM EDTA的1× DPBS溶液。

3. Fc阻断液：含抗小鼠CD16/32抗体（Clone 93）1:100稀释、2%大鼠血清的FACS缓冲液。

4. 分离缓冲液：含0.5%（w/v）BSA的1× DPBS溶液。

5. 消化缓冲液：含1 mg/mL II型胶原酶、2.5 mM CaCl₂的分离缓冲液。

6.抗体组合和染料：

表1. 流式检测脂肪组织巨噬细胞所需抗体组合。

操作步骤：

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参考文献

1.Rosen ED, Spiegelman BM (2014) What we talk about when we talk about fat. Cell 156:20–44

2.Choe SS, Huh JY, Hwang IJ, Kim JI, Kim JB (2016) Adipose tissue remodeling: its role in energy metabolism and metabolic disorders. Front Endocrinol (Lausanne) 7:30

3.Chakarov S, Bleriot C, Ginhoux F (2022) Role of adipose tissue macrophages in obesity-related disorders. J Exp Med 219:e20211948

4.Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW Jr (2003) Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest 112:1796–1808

5.Cox N, Geissmann F (2020) Macrophage ontogeny in the control of adipose tissue biol-ogy. Curr Opin Immunol 62:1–8

6.Cox N, Crozet L, Holtman IR, Loyher PL, Lazarov T, White JB, Mass E, Stanley ER, Elemento O, Glass CK et al (2021) Diet-regulated production of PDGFcc by macro-phages controls energy storage. Science 373: eabe9383

7.Cox, N., Crozet, L., Holtman, I. R., Loyher, P. L., Lazarov, T., White, J. B., Mass, E., Stanley, E. R., Elemento, O., Glass, C. K., & Geissmann, F. (2021). Diet-regulated production of PDGFcc by macrophages controls energy storage. Science (New York, N.Y.), 373(6550), eabe9383. https://doi.org/10.1126/science.abe9383

8.Li X, Ren Y, Chang K, Wu W, Griffiths HR, Lu S and Gao D (2023) Adipose tissue macrophages as potential targets for obesity and metabolic diseases. Front. Immunol. 14:1153915. doi: 10.3389/fimmu.2023.1153915