目的
肺部长期暴露于病原体与各类环境刺激之下，因此肺部感染与炎症反应十分常见。肺泡巨噬细胞（AMs）是宿主抵御病原入侵的核心免疫细胞，在肺部炎症的启动与消退过程中均发挥关键作用。
肺泡巨噬细胞是终末分化的肺组织定居型巨噬细胞，起源于胚胎期。其具有寿命长、在肺发育与功能维持中作用关键，以及对肺部感染和炎症产生器官特异性应答等显著特点。巨噬细胞广泛分布于机体各类组织，其生理功能通常会受到组织微环境的精细调控。例如，肺泡巨噬细胞尤为特殊，具有多项独特的表型与功能特征。与大多数巨噬细胞亚群不同，肺泡巨噬细胞主要依赖有氧氧化磷酸化供能，而非无氧糖酵解。
肺泡巨噬细胞是肺部主要的组织驻留吞噬细胞，占肺巨噬细胞群体的绝大多数。如其名称所示，AMs 主要定位于肺泡腔，以贴壁形式持续监测外界环境并与肺泡上皮细胞相互作用[1]。在稳态肺部，肺泡腔内超过 95% 的吞噬细胞为 AMs[2]；在炎症、感染或长期污染物暴露等情况下，这一细胞组成会发生显著改变。
在此，该Protocol介绍从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离获取肺泡巨噬细胞的常规和进阶方法，并描述了识别肺泡巨噬细胞的流式检测门控策略。
背景
肺微环境是一个结构高度复杂的生态系统，拥有精密的气道与血管网络。吸入气体经气管、多级支气管与细支气管，最终抵达肺泡完成气血交换。由于呼吸道直接与外界环境相通，必须抵御空气颗粒物与污染物的潜在损伤。肺部通过多重物理、化学与免疫屏障实现自我保护，其中吞噬细胞在呼吸表面构成了关键的第一道防线。
正常生理状态下，肺部存在两类主要的组织驻留巨噬细胞群：肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs），主要定位于肺泡腔内；以及间质巨噬细胞（interstitial macrophages, IMs），主要分布于肺间质中。肺泡巨噬细胞（AMs）作为肺泡腔内主要的组织驻留巨噬细胞，是抵御吸入病原体与颗粒物的第一道免疫防线。肺泡巨噬细胞能够高效识别并清除气道与肺泡内的异物，同时还可通过分泌细胞因子及免疫调控分子，调节局部免疫反应。因此，肺泡巨噬细胞兼具免疫监视与免疫调节双重功能，对维持肺部稳态发挥至关重要的作用。位于肺间质内的间质巨噬细胞（IMs），是免疫监视、抗原提呈及组织修复过程的关键参与者。它们可与肺微环境中的各类免疫细胞及结构细胞相互作用，进而统筹调控免疫应答并促进组织修复机制。肺间质巨噬细胞作为核心调控介质，协调免疫系统共同维持肺部结构完整、抵御各类肺组织损伤与健康威胁。当肺脏发生炎性或者损伤应激时，血液里单核细胞会进入肺组织，分化为单核细胞来源巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, Mo‑Mφs），其可进一步分为单核细胞来源间质巨噬细胞（Mo‑IMs）与单核细胞来源肺泡巨噬细胞（Mo‑AMs）两类，在免疫监视、吞噬作用、细胞因子分泌及抗原呈递过程中发挥关键作用。尤为重要的是，单核细胞来源巨噬细胞可有效调控炎症反应，并积极参与组织修复进程，对维持肺功能与肺部健康具有重要意义。
正常情况下，肺部存在两种主要的组织驻留巨噬细胞群：位于肺泡腔内的肺泡巨噬细胞（AM），以及分布在肺间质中的肺间质巨噬细胞（IM）。急性肺损伤发生后，骨髓来源的单核细胞会通过血液循环被招募到肺部。这些单核细胞既可迁移进入肺间质，分化为单核细胞源性间质巨噬细胞（Mo-IMs）；也可进入肺泡腔，分化为单核细胞源性肺泡巨噬细胞（Mo-AMs）。这些不同的巨噬细胞群在急性肺损伤的不同阶段发挥着不同作用：部分具有促炎功能，另一些则具有抗炎或参与组织修复的功能。此外，这些巨噬细胞还与内皮微环境发生动态相互作用[10]。
AMs参与广泛的生物学功能，既调控局部肺部稳态，也影响全身免疫。例如，AMs对肺发育、肺功能维持、免疫监视，以及细胞碎片、入侵病原体与吸入颗粒物的清除至关重要[3-7]。特异性清除AMs会显著削弱呼吸道病毒与细菌的清除能力[4,8]。除作为吞噬细胞与肺部稳态第一道防线外，AMs还可作为抗原呈递细胞启动T细胞免疫、增强鼻内疫苗效果，是气道广谱疫苗的效应者[9]，并影响肺移植后肺部限制性自身免疫反应。AMs功能缺陷与肺泡蛋白沉积症（PAP）密切相关，该病由基因突变、肿瘤或感染导致肺表面活性物质清除障碍引发。目前，AMs 移植已被探索作为 PAP 的潜在治疗策略。
研究证实，AMs起源于胚胎发育时期，并在整个生命周期内稳定存在于肺部，极少被循环白细胞替代。尽管稳态下AMs几乎不发生更新，但在流感病毒感染、清髓性放疗、内毒素暴露及衰老等特定病理生理状态下，其更新率会出现不同程度上升。传统观点认为AMs通过低速率自我增殖维持种群数量；但近年研究表明，实验条件下单核细胞可分化形成血管内肺巨噬细胞，但其在肺部疾病中的功能仍有待阐明。此外，肺部需在炎症信号与免疫调控机制间维持精密平衡，因此探索AMs活化的刺激阈值是极具价值的研究方向。
目前，国际上仍缺乏统一的小鼠AMs分离、鉴定与体外培养标准化方案。AMs 起源与表型定义不统一、实验方法不详尽，是阐明其在肺部健康与疾病中作用的主要障碍。
本Protocol所述方案试图提供了一套明确的从支气管肺泡灌洗液（BALF）中AMs鉴定与分离的策略，以期推动AMs生物学行为研究，并助力以AMs为靶点的诊断与治疗研发。
实验中，所有接触细胞的溶液与器材均需保证无菌，并严格遵循无菌操作规范。由于巨噬细胞对内毒素高度敏感，所用溶液必须为无内毒素级别。为避免巨噬细胞黏附造成损失，建议全程使用聚丙烯（PP）材质耗材，以实现最大细胞回收率。所有试剂与分离后的细胞，在使用前均应置于4℃低温保存。此外，由于肺泡巨噬细胞在肺泡内主要以贴壁形式存在，方法学上要重点关肺泡巨噬细胞洗脱与分离环节（如灌洗液内EDTA的添加）。
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参考文献
1.Westphalen, K. et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506(2014).
2.Guilliams, M. et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GMCSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
3.Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., & Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
4.Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., & McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
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9.Zhang H, Floyd K, Fang Z, et al. Mucosal vaccination in mice provides protection from diverse respiratory threats. Science. Published online February 19, 2026. doi:10.1126/science.aea1260
10.Osorio-Valencia S, Zhou B. Roles of Macrophages and Endothelial Cells and Their Crosstalk in Acute Lung Injury. Biomedicines. 2024;12(3):632. Published 2024 Mar 13. doi:10.3390/biomedicines12030632
11.Nayak DK, Mendez O, Bowen S, Mohanakumar T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J Vis Exp. 2018;(134):57287. Published 2018 Apr 20. doi:10.3791/57287
12.Hoagland DA, Rodríguez-Morales P, Mann AO, et al. Macrophage-derived oncostatin M repairs the lung epithelial barrier during inflammatory damage. Science. 2025;389(6756):169-175. doi:10.1126/science.adi8828