目的

库普弗细胞（Kupffer cells, KCs），是肝脏内的组织驻留巨噬细胞。尽管库普弗细胞仅占肝脏总体积的 5% 以下，却约占机体所有组织固有巨噬细胞总量的 80%。该细胞在机体生理过程以及多种肝脏疾病的发病机制中均发挥关键作用。

为获取高纯度肝实质细胞、以及包含库普弗细胞在内的肝非实质细胞，以用于生化及细胞生理学相关研究，学界已报道多种细胞分离方法。本实验方案所介绍的技术，是一套简便、快捷且专门针对库普弗细胞分离的实验流程。本方法旨在获取大量高纯度、活性良好且功能完整的细胞，同时保证细胞生理特性不发生改变、细胞膜结构不被损伤。

本基础实验方案可大量制备活性完好的库普弗细胞，用于后续各项实验研究。该方法依托肝脏胶原酶原位灌流、体外酶消化，Percoll/OptiPrep密度梯度沉降离心三大核心原理建立。整套实验流程分为六大主要部分：动物预处理、手术操作、肝脏灌流、离心分离、细胞计数与活率检测、细胞接种及培养（可根据需要磁珠或者流式进一步分选纯化）。

本方法常规可同时分离肝非实质细胞（库普弗细胞、肝窦内皮细胞）与肝实质细胞。本Protocol重点细化库普弗细胞的分离纯化。

背景

肝脏是人体最大的实质性腹腔脏器，共四叶，分为左叶、右叶、方叶、尾状叶，有两套血管供血系统。肝脏基本结构单位是肝小叶，呈六角棱柱形。肝小叶中心是中央静脉。肝细胞排列成条索状，放射状围绕中央静脉构成肝索。肝索之间的空隙，毛细血管网构成肝血窦。窦内血流缓慢，库普弗细胞（KCs）就定居在肝血窦内壁上，这就是分离库普弗细胞必须门静脉灌流的根本原因。肝细胞与血窦之间的间隙，即为窦周隙（Disse 隙），肝星状细胞 HSC位于此处。

肝脏精巧的结构使其能够行使多项生理功能。肝脏内分布着独特的脉管系统，肝脏是全身唯一拥有双重供血的器官。其拥有混合型血供：肠道来源的静脉血经门静脉汇入肝脏，并在门管区与肝动脉输送的含氧动脉血相混合（图 1）。富含营养的混合血液流经被称为肝血窦的特化毛细血管网，最终汇入中央静脉。在门静脉与中央静脉之间，肝脏由大量重复的功能单位构成，即肝小叶。传统观点认为，肝小叶是以中央静脉为中心排布的重复六边形结构。门管区与中央静脉之间的血窦内皮周边分布着执行肝脏核心生理功能的肝实质细胞。这些实质细胞呈分区化分布，即在靠近中央静脉与门管区的不同区域，细胞功能及基因表达均存在差异性极化。

双重供血系统：肝动脉（1/4供血量）和门静脉（3/4供血量）共同供血。 血液流动路径：肝动脉和门静脉分支→小叶间动脉/静脉→肝血窦（混合血液，特化毛细血管，血流缓慢）→中央静脉→小叶下静脉→肝静脉→下腔静脉→汇入体循环（图 1）。

图1. 肝小叶的巨噬细胞及血流系统。

肝脏细胞分为两大类：肝实质细胞（肝细胞） + 肝非实质细胞（Non-parenchymal cells，NPCs）。肝实质细胞 Hepatocytes（PCs），占肝脏细胞总数70%~80%，是肝脏最主要的细胞。肝非实质细胞 （NPCs），研究较多的是肝窦内皮细胞（LSECs），库普弗细胞（KFs）和肝星状细胞（HSCs）。所占比例和基本功能见表1.

表1.肝脏主要细胞构成

基于对肝脏结构，血流系统，细胞构成，以及库普弗细胞（KFs）空间位置的理解和认知，对于后续分离步骤和数据质控，都有积极和主动的辅助作用。

肝脏库普弗细胞的分离，相对于其脏器，比如脾脏；或者其他部位，比如腹腔等，在流程和细节上，都要更加复杂。分离肝脏巨噬细胞充满一定的难度和挑战，因此，目前已有诸多关于肝脏库普弗细胞分离方法的报道。

库普弗细胞嵌在肝血窦里面，紧紧贴着血管壁、被肝细胞、肝基质包裹，直接剪碎肝脏根本拿不到完整活细胞。因此，原位冲洗和灌注消化至关重要，是成功分离肝脏巨噬细胞的关键两步。

第一步：门静脉灌洗液灌流 —— 先 “洗血、冲散、撑开肝血窦”。

● 冲干净肝脏内所有血液、红细胞。肝脏血流极度丰富，不灌流的话后续全是红细胞污染，细胞纯度极差，后续养细胞发黑、背景脏。

● 撑开肝血窦，松动库普弗细胞。库普弗细胞就定居在肝血窦内壁上，肝脏实体致密，灌流液进入肝小叶，把血窦撑开，让黏附在壁上的库普弗细胞从血管壁上松动下来。

● 灌流去除肝内游离血细胞、免疫杂细胞为后续只富集肝固有巨噬细胞做铺垫。

第二步：Ⅳ型胶原酶原位消化 —— 解离组织间隙连接。

灌洗液只是冲洗，不能破坏组织连接；肝脏细胞之间靠细胞外基质、胶原纤维牢牢绑在一起。胶原酶 Ⅳ专门降解组织间质胶原，作用：

● 松散肝小叶结构、解离肝细胞与血窦壁连接

● 让原本嵌在血窦里的库普弗细胞完全游离出来

● 只温和消化间质，不大量损伤巨噬细胞膜

如果只灌流不消化：肝脏还是致密组织，剪碎后全是组织块，细胞出不来，离心全是组织碎片，得不到单细胞悬液。当然，使用仪器均质化肝脏，加之各种消化酶的组合消化，也可以得到肝脏原位冲洗及消化的效果，但是，血液中细胞组分会污染肝脏样品，这是一个限制。

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参考文献

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