目的

脾脏是人体重要的免疫和滤血器官，其细胞组成主要包括淋巴细胞（T细胞、B细胞）、巨噬细胞、树突状细胞、红细胞、血小板及相关基质细胞。脾脏由边缘区分隔为红髓、白髓两大解剖区域，据此可划分不同巨噬细胞群体：红髓巨噬细胞，白髓巨噬细胞和边缘区巨噬细胞。脾脏边缘区存在两类特征明确的巨噬亚群：边缘区金属嗜性巨噬细胞（MMM）和边缘区巨噬细胞（MZM）。鉴于脾脏细胞群体的多样性和解剖位置的复杂性，脾脏巨噬细胞分离说难不“难”，本质上不是“取不出来”的难，而是“从复杂组织中精准获取特定亚群”的难。本文介绍一种利用三酶法充分无偏漏的分离小鼠脾脏中不同巨噬细胞亚群的实验方案。

背景

脾脏是是机体最大的淋巴器官。作为T细胞和B细胞定居的场所，T细胞占40%, B细胞占60%。脾脏实质分为白髓、红髓和边缘区三部分。脾脏的结构可区分为两个隔室：含有血液的红髓，以及充满淋巴样细胞的白髓。

图1. 小鼠脾脏横截面示意图[1]。

红髓为白髓和边缘区外侧的扩大区域，充满血液。红髓又可分为脾索和脾血窦。在红髓中，病原体、细胞碎片以及衰老的红细胞会被该区域丰富的红髓巨噬细胞有效地从血液中清除。这些巨噬细胞随后能很好地从红细胞中回收铁。

白髓包括动脉周围淋巴鞘（PALs，为T细胞富集区，是胸腺依赖区）、脾小结（B细胞富集区，是非胸腺依赖区）。白髓是一个高度组织化的淋巴区域，适应性免疫反应在此启动。它由B细胞和T细胞的独立区域组成，这些区域被边缘区所包围——边缘区包含不同亚群的巨噬细胞和B细胞。尽管血液可以自由流经边缘区，但白髓被排除在血流之外，需要特定的信号才能进入。

图2.小鼠脾脏白髓和红髓HE染色图。

白细胞进入白髓需要激活G蛋白偶联受体，这一过程类似于白细胞离开血流、进入淋巴结或炎症部位的多步外渗过程。边缘区在先天免疫和适应性免疫反应之间架起了一座桥梁，因为该区域的巨噬细胞表达特定的模式识别受体，能有效地摄取血源性病原体。该区域中特定B细胞亚群，即边缘区B细胞，可被这些巨噬细胞激活，或直接对血源性病原体做出反应，之后它们成为抗原呈递细胞或产生IgM的浆细胞[2]。

在淋巴器官中，脾脏特别适合于清除血源性病原体。从显微解剖学来看，脾脏分为白髓和红髓（Rp），两者由边缘区（MZ）分隔。红髓和边缘区拥有复杂的巨噬细胞（MΦ）网络，这些巨噬细胞在感染免疫应答中具有不同的起源和功能。红髓巨噬细胞（RpMΦs）在红髓内形成庞大的网络，在小鼠中以表达F4/80^high CD68^+ CD11b^low/− 和强烈的自发荧光为特征。而在边缘区内，可以区分出两个巨噬细胞群体。边缘区巨噬细胞（MZMΦs）通常在表面表达C型凝集素SIGN相关蛋白1（SIGNR1）和一种称为含胶原结构巨噬细胞受体（MARCO）的I型清道夫受体，这些受体识别非调理素化分子，主要是血源性抗原。此外，边缘区金属噬性巨噬细胞（MMMΦs）的定义包括表达唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1（Siglec-1，唾液酸粘附素，CD169）和MOMA-1等其他分子。脾脏结构以及巨噬细胞的一般示意图如图3所示。

图3.脾脏巨噬细胞亚群的定位与表型。该图概要展示了红髓巨噬细胞（RpMΦs）、边缘区巨噬细胞（MZMΦs）和边缘区金属噬性巨噬细胞（MMMΦs）在脾脏内的定位及其各自的表型标志物。RpMΦs（褐色）通常位于红髓内的索状结构中，能够与通过静脉窦的红细胞及其他血细胞/颗粒直接接触。其更好的界定标准是同时表达F4/80、CD11b（低水平）和CD68，以及其他辅助其功能的受体。MZMΦs（绿色）位于边缘区（MZ）的外层，同样与血源性颗粒直接接触。这些细胞表面表达MARCO和SIGNR1分子，以及其他有助于摄取血源性病原体的受体。最后，MMMΦs（棕色）位于边缘区内层，与白髓相接触。它们也专门负责摄取血源性颗粒，并表达SIGLEC-1和MOMA-1等表面标志物[3]。

清除小鼠脾脏巨噬细胞时，可通过尾静脉或者腹腔注射给药巨噬细胞清除套装Cell-Del®Clodronate Liposomes and Control Liposomes（Cat.: C283539）氯膦酸盐脂质体和对照脂质体。除了使用常见的流式细胞术评价清除效果，还可以使用免疫组化（IHC）或者免疫荧光（IF），这两种手段都可以样品原位检测。在流式细胞术或荧光显微镜实验中，需注意红髓巨噬细胞强烈的自发荧光可能会与外加的荧光染料（尤其是绿色通道如FITC）信号重叠，造成假阳性结果。巨噬细胞清除效果时间动态曲线可参考如图4。

图4.小鼠尾静脉注射氯膦酸盐脂质体试剂和对照脂质体试剂后，取样脾脏免疫组化检测F4/80[4]。

巨噬细胞具有高度异质性和可塑性。如何能够有效分离，分群和鉴定巨噬细胞，对评价氯膦酸盐脂质体清除效果和研究巨噬细胞功能，就显得尤为关键和重要。本Protocol详细介绍和对比利用传统机械研磨法和三种酶混合消化法分离小鼠脾脏巨噬细胞并流式细胞术检测的实验方法。

流式抗体

● BD Biosciences：FITC 标记抗小鼠 CD19、NK1.1、Ly6G；PE 标记抗小鼠NK1.1、B220、Ly6G；PE-CF594 标记 SiglecF；APC-Cy7 标记 CD11b；V500 标记 I-A/I-E；小鼠 IgG1 κ、大鼠 IgG2a κ 同型对照。

● Tombo Biosciences：FITC/PE 抗小鼠 CD3；FITC/PE 大鼠 IgG2a 同型对照；抗小鼠 CD16/32 封闭抗体。

● BioLegend：PE-Cy7 CD11c、AF700 Ly6C、PE/PE-Cy7 Tim4、PE CD64；Zombie Violet 活死细胞染色试剂盒。Bio-Rad：AF647 标记 F4/80。

● 美天旎：PE 抗小鼠 SIGNR1 及对应 REA 同型对照。

● Abcam：FITC 标记 CD169（金属嗜性巨噬细胞标志物）。

操作步骤：

详细Protocol关注公众号

参考文献

1.Bronte V, Pittet MJ. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 2013;39(5):806-818. doi:10.1016/j.immuni.2013.10.010

2.Mebius, R., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nat Rev Immunol 5, 606–616 (2005). https://doi.org/10.1038/nri1669

3.Borges da Silva H, Fonseca R, Pereira RM, Cassado AA, Álvarez JM and D’Império Lima MR (2015) Splenic Macrophage Subsets and Their Function during Blood-Borne Infections. Front. Immunol. 6:480. doi: 10.3389/fimmu.2015.00480

4.Chunyan Fu et al. ,Macrophage-targeted Mms6 mRNA-lipid nanoparticles promote locomotor functional recovery after traumatic spinal cord injury in mice. Sci. Adv. 11,eads2295(2025).DOI:10.1126/sciadv.ads2295

5.Fujiyama, S., Nakahashi-Oda, C., Abe, F., Wang, Y., Sato, K., & Shibuya, A. (2019). Identification and isolation of splenic tissue-resident macrophage sub-populations by flow cytometry. International immunology, 31(1), 51–56. https://doi.org/10.1093/intimm/dxy064