目的
真皮（Dermis）内分布着密集的组织巨噬细胞网络，这类细胞参与维持组织稳态、调控炎症反应以及清除病原体。真皮巨噬细胞部分依靠循环单核细胞进行补充，当组织受损或发生炎症时，单核细胞会大量浸润，扩充组织驻留巨噬细胞群体。真皮组织结构复杂，内部包含血管、淋巴管、毛球、皮脂腺以及外周神经，这种复杂微环境能够诱导分化出多种特征各异的巨噬细胞亚群。机体处于稳态时，依据细胞表面标志物表达水平以及细胞在真皮内的定位，可区分出多种独立的巨噬细胞亚型。本Protocol将详细介绍从皮肤组织中分离真皮巨噬细胞的实验方法，并重点阐述多种分群圈门策略，用以鉴别单核细胞与各类巨噬细胞群体。
背景
皮肤是人体的外部屏障，由多层结构构成 [1]。最外层为表皮，负责隔绝外界环境。表皮主要由角质形成细胞组成，表皮与真皮之间由基底膜（皮表皮连接区）分隔。表皮内含有朗格汉斯细胞，这是一类数量丰富的特化组织巨噬细胞，生理稳态下可实现细胞自主更新维持种群规模 [2]。有趣的是，朗格汉斯细胞在部分特性上与树突状细胞相近：它们能够迁移至淋巴结完成抗原呈递，还表达树突状细胞特异性转录因子 Zbtb46 [3]。但同时，从细胞起源与 MafB 蛋白表达特征来看，朗格汉斯细胞又具备巨噬细胞的典型特征 [3]。除此之外，小鼠表皮中还存在树突状表皮 T 细胞，这类细胞起源于卵黄囊，拥有自我更新能力 [4]。表皮无自身供血系统，微环境相对稳定；而作为皮肤内层的真皮，细胞组成则复杂得多。真皮以结缔组织为主体，结缔组织中的胶原蛋白由成纤维细胞合成，真皮内部还分布着各类供养结构，包括血管、神经、汗腺以及淋巴管。除此以外，真皮内栖息着多种免疫细胞，例如肥大细胞、树突状细胞、γδ 型与 αβ 型组织驻留 T 细胞，以及巨噬细胞。
图1.皮肤内各类细胞分布的示意图。脊椎动物的皮肤分为两大结构区域：表皮与真皮。表皮最表层为角质层，由死亡的角质形成细胞构成，发挥物理屏障作用。表皮细胞排布致密、血管稀少，主要细胞类型是角质形成细胞，仅含少量黑色素细胞。表皮内主要免疫细胞包含朗格汉斯细胞、树突状表皮 T 细胞（属于 γδ T 细胞亚群）以及 CD8 阳性 T 细胞。
真皮血管分布丰富，富含胶原蛋白与弹性纤维，细胞整体密度偏低。真皮中存在成纤维细胞、T 细胞（CD4 阳性 αβ 型 T 细胞、γδ 型 T 细胞）、固有淋巴细胞、真皮树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞与中性粒细胞等 [25]。
真皮巨噬细胞是真皮内占比最高的免疫细胞。在胎儿出生前后及出生后短期内，真皮巨噬细胞会快速适应子宫外环境，分化形成异质性的成熟细胞群。与表皮朗格汉斯细胞不同，现有研究认为生理稳态下真皮巨噬细胞持续依靠循环单核细胞更新，这一特点与肠道巨噬细胞类似 [5,6]。但早期研究并未充分认识真皮巨噬细胞复杂多样的亚群构成：黑色素吞噬细胞（胞内蓄积黑色素的巨噬细胞）光散射信号极强，流式细胞检测时会被直接剔除，因此相关亚群未能纳入分析 [7]。
近年研究发现，肠道内存在局部自主更新的巨噬细胞亚群，这类细胞常分布于血管、肠神经系统或派尔集合淋巴结周边 [8,9]。与之类似，该团队鉴定出一类胚胎起源的真皮巨噬细胞亚群，该亚群依附于感觉神经分布，生理稳态下依靠自身增殖维持种群，单核细胞对其补充作用极低 [10,11]。这类巨噬细胞会巡查真皮感觉神经轴突，修剪髓鞘，还能在机械损伤后促进轴突再生。该亚群高表达趋化因子受体 CX3CR1，而其他真皮巨噬细胞出生后会下调该受体表达。迁入皮肤的高 Ly6C 单核细胞 CX3CR1 表达水平中等，分化成熟后同样会下调该受体 [5,10]。
基于应用广泛的 Cx3cr1 绿色荧光蛋白杂合报告基因小鼠模型 [12,13]，成年小鼠真皮巨噬细胞可划分为三大亚群；三类亚群共存于真皮组织，但在细胞起源、更新方式、组织定位及生理功能上存在显著差异 [10]。该分类体系中，CX3CR1 低表达亚群是成年真皮中数量最多的巨噬细胞群体，占比超 80%。该研究团队及其他课题组证实，该亚群大量依赖单核细胞补充，但小鼠皮肤 [7,10,14] 与人类皮肤 [15] 中均存在一部分更新极慢甚至几乎不更新的细胞。这一结论也得到另一项实验佐证：CCR2 基因敲除小鼠体内单核细胞发育缺陷，但其真皮巨噬细胞数量正常，说明组织驻留巨噬细胞可通过自身增殖代偿种群规模 [10,16]。目前，调控该亚群细胞命运与更新替换的关键因子仍有待挖掘。
图2.周龄4周的小鼠皮肤巨噬细胞荧光标记。表皮、真皮浅层（乳头层）、真皮深层（网状层）组织中的 Ccr2-RFP 与 Cx3cr1-GFP 荧光标记的巨噬细胞。
过往研究还会依据 Ly6C 与 MHC II 类分子的表达差异对真皮巨噬细胞分群 [5,7]。单核细胞被定义为 Ly6C 阳性、CCR2 阳性、CD64 低表达细胞。在 CD64 高表达细胞群内，根据是否表达 MHC II 类分子划分出两类巨噬细胞亚群，分别命名为 P5（MHC II 阳性）与 P4（MHC II 阴性）[5,7]。该分类下，相较于 MHC II 阳性巨噬细胞，MHC II 阴性巨噬细胞的细胞替换速率更低，自主更新能力更强 [7,17]。成熟的组织间驻留巨噬细胞会上调甘露糖受体 CD206 [18]，但神经相关巨噬细胞不表达该分子 [10]。另有研究指出，透明质酸受体 Lyve1 可特异性标记沿特定血管分布的巨噬细胞 [19,20]。
稳态真皮中巨噬细胞是优势免疫细胞，在机体抵御金黄色葡萄球菌等条件致病菌的免疫防御过程中发挥不可替代的核心作用 [21,22]。值得注意的是，组织驻留巨噬细胞的表面分子表达谱（免疫表型）会在组织损伤或感染时发生改变；同时炎症细胞大量浸润，也会大幅提升该条件下巨噬细胞的分群鉴定难度。MHC II 类分子就是典型的诱导型表面标志物：该分子表达水平受外界刺激调控，干扰素 γ 等刺激物可诱导其表达上调 [23]。因此科研人员使用该标志物划分巨噬细胞亚群时需谨慎，其表达具有动态波动性；只有借助谱系示踪技术标记组织固有细胞，才能精准、可靠地鉴定原本存在的巨噬细胞亚群。而根据本团队实验经验，CD64 分子在感染或损伤状态下表达稳定，单核细胞分化为巨噬细胞后 CD64 表达也会显著上调，是可靠标志物 [10,21]。
绝大多数相关研究均采用小鼠耳部皮肤分离真皮巨噬细胞。但需要注意，人体不同解剖部位皮肤的细胞组分存在差异；已有研究证实，有毛皮肤与无毛皮肤中巨噬细胞、表皮 γδ T 细胞等免疫细胞的占比均不相同 [24]。因此在横向对比不同研究的实验结果时，必须考虑皮肤取材部位带来的差异。
此外，还需要考虑周龄因素。研究发现，位于真皮上层，也就是乳头层、特别是与浅表毛细血管丛相关的巨噬细胞一称为毛细血管相关巨噬细胞(CAMs)的丢失速度显著高于表皮或真皮下层的巨噬细胞。该真皮乳头层CAMs数量随年龄增加显著减少，远超其他皮肤层次，表明这是生态位特异性的巨噬细胞流失。更关键的是，这种现象在人类身上也存在[26]。
当使用ClodronteLiposomes氯膦酸盐脂质体清除套装（Cat：C283539）清除皮肤巨噬细胞时，如果关注定居的巨噬细胞，一般通过原位皮内注射(intradermal injections)，3ul~5ul/点位，每3天一次，免疫荧光来评价清除体系。如果关注招募来源巨噬细胞，优先尾静脉注射。
图3.Clodronateliposomes氯膦酸盐脂质体特异清除毛细血管相关巨噬细胞。巨噬细胞（Csf1r-eGFP 标记）、毛细血管（R26mTmG 标记）与红细胞血流（third harmonic三次谐波成像标记）。
总而言之，系统、精准地表征真皮巨噬细胞，是全面解析其在生理稳态与疾病状态下细胞更新动力学特征、生物学功能的关键前提。本Protocol旨在为科研人员提供一套完整的实验方案工具包，借助流式细胞术实现真皮巨噬细胞的稳定、可靠检测分析。
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参考文献
1.Kabashima K, Honda T, Ginhoux F, Egawa G. The immunological anatomy of the skin. Nature Reviews Immunology, 2019, 19(1): 19-30. https://doi.org/10.1038/s41577-018-0084-5
2.Schulz C, Gomez Perdiguero E, Chorro L, et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science, 2012, 336(6077): 86-90. https://doi.org/10.1126/science.1219179
3.Wu X, Briseño CG, Durai V, et al. Mafb lineage tracing to distinguish macrophages from other immune lineages reveals dual identity of Langerhans cells. Journal of Experimental Medicine, 2016, 213(12): 2553-2565. https://doi.org/10.1084/jem.20160600
4.Gentek R, Ghigo C, Hoeffel G, et al. Epidermal γδ T cells originate from yolk sac hematopoiesis and clonally self-renew in the adult. Journal of Experimental Medicine, 2018, 215(12): 2994-3005. https://doi.org/10.1084/jem.20181206
5.Tamoutounour S, Guilliams M, Montanana Sanchis F, et al. Origins and functional specialization of macrophages and of conventional and monocyte-derived dendritic cells in mouse skin. Immunity, 2013, 39(5): 925-938. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2013.10.004
6.Sieweke MH, Allen JE. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science, 2013, 342(6161): 1242974. https://doi.org/10.1126/science.1242974
7.Baranska A, Shawket A, Jouve M, et al. Unveiling skin macrophage dynamics explains both tattoo persistence and strenuous removal. Journal of Experimental Medicine, 2018, 215(4): 1115-1133. https://doi.org/10.1084/jem.20171608
8.De Schepper S, Verheijden S, Aguilera-Lizarraga J, et al. Self-maintaining gut macrophages are essential for intestinal homeostasis. Cell, 2018, 175(2): 400-415.e413. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.048
9.Shaw TN, Houston SA, Wemyss K, et al. Tissue-resident macrophages in the intestine are long lived and defined by Tim-4 and CD4 expression. Journal of Experimental Medicine, 2018, 215(6): 1507-1518. https://doi.org/10.1084/jem.20180019
10.Kolter J, Feuerstein R, Zeis P, et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity, 2019, 50(6): 1482-1497.e1487. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.05.009
11.Kolter J, Kierdorf K, Henneke P. Origin and differentiation of nerve-associated macrophages. Journal of Immunology, 2020, 204(2): 271-279. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1901077
12.Jung S, Aliberti J, Graemmel P, et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20: 4106-4114
13.Yona S, Kim KW, Wolf Y, et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity, 2013, 38(1): 79-91. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2012.12.001
14.Ginhoux F, Guilliams M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity, 2016, 44(3): 439-449. https://doi.org/10.1016/j.immuni.20
16.02.024
15.McGovern N, Schlitzer A, Gunawan M, et al. Human dermal CD14(+) cells are a transient population of monocyte-derived macrophages. Immunity, 2014, 41(3): 465-477. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2014.08.00616.Lohrmann F, Forde AJ, Merck P, Henneke P. Control of myeloid cell density in barrier tissues. The FEBS Journal, 2021, 288(2): 405-426. https://doi.org/10.1111/febs.15436
17.Sheng J, Ruedl C, Karjalainen K. Most tissue-resident macrophages except microglia are derived from fetal hematopoietic stem cells. Immunity, 2015, 43(2): 382-393. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2015.07.016
18.Hoeffel G, Debroas G, Roger A, et al. Sensory neuron-derived TAFA4 promotes macrophage tissue repair functions. Nature, 2021, 594(7861): 94-99. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03563-7
19.Chakarov S, Lim HY, Tan L, et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science, 2019, 363(6432): eaau0964. https://doi.org/10.1126/science.aau0964
20.Lim HY, Lim SY, Tan CK, et al. Hyaluronan receptor LYVE-1-expressing macrophages maintain arterial tone through hyaluronan-mediated regulation of smooth muscle cell collagen. Immunity, 2018, 49(2): 326-341.e327. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.06.008
21.Feuerstein R, Forde AJ, Lohrmann F, et al. Resident macrophages acquire innate immune memory in staphylococcal skin infection. eLife, 2020, 9. https://doi.org/10.7554/eLife.55602
22.Feuerstein R, Seidl M, Prinz M, Henneke P. MyD88 in macrophages is critical for abscess resolution in staphylococcal skin infection. Journal of Immunology, 2015, 194(6): 2735-2745. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1402566
23.Kiritsy MC, Ankley LM, Trombley J, et al. A genetic screen in macrophages identifies new regulators of IFN-γ-inducible MHCII that contribute to T cell activation. eLife, 2021, 10: e65110. https://doi.org/10.7554/eLife.65110
24.Tong PL, Roediger B, Kolesnikoff N, et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. Journal of Investigative Dermatology, 2015, 135(1): 84-93. https://doi.org/10.1038/jid.2014.289
25.Chong SZ, Evrard M and Ng LG (2013) Lights, Camera, and Action: Vertebrate Skin Sets the Stage for Immune Cell Interaction with Arthropod-Vectored Pathogens. Front. Immunol. 4:286. doi: 10.3389/fimmu.2013.00286
26.Mesa, K.R., O’Connor, K.A., Ng, C. et al. Niche-specific dermal macrophage loss promotes skin capillary ageing. Nature 648, 173–181 (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09639-y