目的: Cre/loxP 系统是小鼠体内定点基因编辑领域应用十分广泛的技术。借助该系统，可在特定细胞、组织乃至全身范围内敲除目的基因，构建多种条件性基因敲除小鼠品系。此外，Cre/loxP 系统还可用于构建细胞 / 组织特异性示踪报告小鼠，以及小鼠细胞特异性条件性基因敲除模型。

靶向巨噬细胞常用 Cre 工具小鼠分三大类：

● 组成型Cre

● 他莫昔芬等诱导型CreERT2

● 组织驻留巨噬细胞特异Cre。

近年来，Cre/loxP 技术被大量用于小鼠模型中单核细胞 / 巨噬细胞相关生物学功能研究。中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞等免疫细胞类群均一性相对较高，与之不同，单核细胞 / 巨噬细胞群体高度异质，缺乏专属的特异性标志物或转录因子。过去十年来，科研人员虽大力研发巨噬细胞特异性 Cre 工具小鼠，但现有所有品系在内源巨噬细胞的敲除效率与靶向特异性方面均存在缺陷。本文综述目前常用的巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠品系，并阐述其主要应用场景与存在局限。

背景: Cre/loxP 系统是一种位点特异性基因修饰技术，已被广泛用于在小鼠特定 DNA 位点实现基因敲除、插入、倒位与染色体易位操作 [1]。该系统包含两大核心元件：Cre 重组酶与 loxP 位点。

Cre 重组酶最初来源于 P1 噬菌体，可特异性识别 loxP 位点 —— 一段长 34 个碱基对、具有方向性的不对称 DNA 序列。根据两个 loxP 位点的相对朝向，Cre 重组酶可切除两个位点之间的转基因序列，或将其序列发生倒位。因此，Cre/loxP 系统能够实现多种 DNA 序列重排，使其成为小鼠研究中用途最广泛的基因操作工具之一 [2，3]。

Cre/loxP 系统最主要的用途是构建小鼠细胞 / 组织特异性条件性敲除等位基因模型 [4]。该模型构建方法为：在目的基因两段内含子区域分别敲入一个 loxP 位点；将该 loxP 定点敲入小鼠品系，与另一株由细胞 / 组织特异性基因启动子调控 Cre 重组酶表达的工具小鼠进行配繁。在表达 Cre 的特定细胞或组织内，两个 loxP 位点间的目的基因会被切除，实现条件性基因敲除。

如图 1 示例：将髓单核细胞特异性溶菌酶 M（LysM）-Cre 小鼠，与目的基因（基因 A）纯合 loxP 锚定小鼠交配，子一代将获得 loxP 杂合子代；再将杂合子代回交至 loxP 纯合小鼠，即可得到携带 Cre、且目的基因 A 为 loxP 纯合的实验小鼠。该实验小鼠体内，仅 LysM 阳性髓单核细胞中的基因 A 发生敲除，LysM 阴性细胞不受任何影响。这类细胞 / 组织特异性敲除模型，能够精准解析目的基因在特定细胞、组织中的功能。

图1.利用 Cre/loxP 技术构建 LysM 阳性细胞特异性条件性基因敲除小鼠。首先将 LysM-Cre 转基因小鼠与目的基因 A 两侧带有 loxP 位点的纯合小鼠交配。子代中约 50% 个体为目的基因 A loxP 杂合子，同时携带单拷贝 / 杂合 Cre 转基因。该 F1 代小鼠仅在 LysM 阳性细胞中实现目的基因 A 的杂合敲除。将 F1 代小鼠再次与 loxP 锚定基因 A 纯合的亲本小鼠回交，后代中约 25% 为实验小鼠，这类小鼠的目的基因 A 为 loxP 纯合，同时携带单拷贝 / 杂合 Cre 转基因。在该 F2 代小鼠体内，Cre 介导的基因切除可仅在 LysM 阳性细胞中实现目的基因 A 纯合敲除。其余 F2 同窝小鼠可作为对照组，包括仅携带纯合 loxP 片段但无 Cre 转基因的小鼠、以及 loxP 杂合且携带单拷贝 / 杂合 Cre 转基因的小鼠。

若将 Cre 重组酶基因与雌激素受体（ER）编码基因融合（Cre-ER），得到的 Cre 工具小鼠可通过给予雌激素拮抗剂他莫昔芬（Tamoxifen），实现 loxP 锚定基因的时间可控性调控 [5]。该体系对于特定细胞 / 组织基因敲除会造成胚胎致死的研究场景尤为关键。

除此之外，Cre/loxP 系统还被广泛用于构建条件性基因激活 / 过表达小鼠、细胞示踪或谱系示踪报告小鼠、细胞特异性条件性细胞清除模型 [6]。以图 2 所示条件性基因激活品系构建为例：在目的基因（基因 B）上游插入转录终止序列（如多聚腺苷酸化信号），阻断目的基因转录；该终止序列两侧携带 loxP 位点，构成 “lox-stop-lox” 元件。将该品系与 LysM-Cre 转基因小鼠交配后，Cre 重组酶会切除终止序列，仅在 LysM 阳性髓单核细胞中启动基因 B 表达。该基因激活 / 过表达模型属于功能获得型研究手段，可精准解析目的基因在特定细胞、组织中的作用。

采用相同构建思路，若图 2 中的基因 B 为可视化标记基因（绿色荧光蛋白 GFP、红色荧光蛋白 RFP、tdTomato、LacZ 等），即可构建髓单核细胞特异性报告小鼠 [6]。报告小鼠可在体内时空动态追踪目标细胞；且 Cre 介导的报告基因激活具备不可逆性，会从母代细胞稳定传递至子代细胞，因此也适用于细胞谱系示踪，追溯特定细胞的发育起源。

另外，若图 2 中的基因 B 替换为白喉毒素受体（DTR）或同类元件，该构建策略还可用于制备细胞特异性条件性清除模型 [7]。该模型中，Cre 切除 lox-stop-lox 元件后会启动 DTR 表达；后续给予白喉毒素（DT），即可诱导性特异性清除全部 LysM 阳性细胞。这类细胞清除模型有助于解析特定细胞类群在生理、病理状态下的全身性功能。

图2.Cre/loxP 系统用于构建条件性基因激活小鼠品系。在启动子与基因 B 编码序列之间插入两侧带有 loxP 位点的转录终止序列（STOP），得到基因 B-loxP 转基因小鼠，该终止序列会阻断基因 B 表达。将该基因 B-loxP 转基因小鼠与 LysM-Cre 小鼠交配，子代小鼠仅在 LysM 阳性细胞中特异性表达基因 B。该体系可用于构建细胞特异性报告小鼠、条件性基因激活 / 过表达小鼠以及条件性细胞清除小鼠品系。

Cre/loxP 系统最主要的局限之一是脱靶效应。大量文献报道，许多 Cre 转基因小鼠品系会在非目标细胞或组织中表达 Cre 重组酶。这类脱靶效应会干扰条件性基因敲除模型、报告基因模型、细胞清除模型以及其他基于 Cre/loxP 的基因工具所得到的实验结果。因此，针对每一种 Cre 转基因小鼠品系，都必须全面检测并记录其 Cre 重组效率（作用敏感度）与表达分布模式（靶向特异性）。

为此，美国杰克逊实验室搭建了 Cre 资源数据库，旨在为科研工作者提供经过完整鉴定的各类 Cre 转基因小鼠品系，以及与之相关的高通量检测数据 [2]。

目前已有的巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠，主要依据单核 / 巨噬细胞标志物构建，包括溶菌酶 M（LysM）、集落刺激因子 1 受体（CSF1R，又称 CD115）、CD11b、F4/80、CX3C 趋化因子受体 1（CX3CR1）等 [8]，但上述品系均无法实现完全特异性靶向。依托这些 Cre 工具小鼠，科研人员构建了大量条件性基因敲除品系、报告基因品系与细胞清除品系，用于探究巨噬细胞谱系在胚胎发育与成年阶段的分化过程，以及巨噬细胞在小鼠组织稳态维持、各类病理进程中的功能作用。下文将介绍这些 Cre 工具小鼠的主要应用场景与靶向特异性。每种品系均附带小鼠基因组信息学数据库（MGI，网址：http://www.informatics.jax.org/）的收录编号，可通过该数据库查询品系详细资料。

常用巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠概述：

LysM-Cre (MGI:1934631)

溶菌酶是真核生物固有免疫细胞广泛合成的一类抗菌酶。作为糖苷水解酶的一种，溶菌酶的抗菌机制是切割细菌细胞壁的肽聚糖 [9]。小鼠体内存在两种溶菌酶编码基因 Lyz1 与 Lyz2，分别编码溶菌酶 P（LysP）和溶菌酶 M（LysM）。LysP 仅在小肠潘氏细胞中表达，而 LysM 特异性表达于小鼠髓单核细胞，包括单核细胞、巨噬细胞与粒细胞 [10]，因此 LysM 可作为髓单核细胞的标志物。

1999 年，克劳森等人通过定点插入技术将 Cre 互补 DNA 整合至内源 LysM 基因位点，构建出 LysM-Cre 小鼠 [11]。将 LysM-Cre 小鼠与两种携带不同 loxP 锚定靶基因（β 聚合酶、转录因子 RX5）的小鼠品系交配后，腹腔分离或骨髓来源的成熟巨噬细胞、粒细胞中靶基因敲除效率极高；而 B 淋巴细胞、T 淋巴细胞等淋巴系细胞中未检测到基因敲除现象 [11]。

后续福斯特等人利用同源打靶载体，将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因与两侧带有 loxP 位点的新霉素抗性（neo）基因一同定点敲入 LysM 基因位点，构建了 LysM 报告小鼠品系 [12]。借助该报告小鼠证实，外周血、腹腔、骨髓内 EGFP 阳性细胞绝大多数为髓单核细胞 [12]。将该 LysM 报告小鼠与 Cre 表达小鼠再次交配，Cre 重组酶会切除 loxP 之间的 neo 抗性基因，子代可获得 LysM 基因缺陷型小鼠 [13]。使用无致病性细菌对 LysM 缺陷小鼠与野生型（WT）对照小鼠进行攻毒实验后发现，缺陷小鼠会产生持续时间更长、强度更高的炎症应答。这一结果说明，髓单核细胞可及时清除细菌及其诱发免疫应答的产物，在抗感染过程中发挥关键作用 [13]。

自 LysM-Cre 品系构建完成以来，该工具小鼠已被广泛用于制备报告小鼠，以在生理及病理状态下对巨噬细胞与其他髓单核细胞开展体内示踪或谱系追踪研究。例如，将 LysM-Cre 小鼠与 ROSA26-flox-stop-flox-EYFP（Rosa26-LSL-EYFP）小鼠交配获得髓单核细胞报告小鼠后，研究发现黄色荧光蛋白（YFP）不仅在髓单核细胞中表达，还可在一部分长期造血干细胞（LT-HSC）以及巨核红系祖细胞（MEP）中检出，这提示小鼠造血干 / 祖细胞（HSPC）阶段即可广泛表达 LysM。造血干祖细胞向髓单核细胞分化大概率是固有分化方向，而向其他细胞谱系分化则需要额外转录因子主导调控 [14]。

将 LysM-Cre 小鼠与各类 loxP 锚定小鼠品系交配，可构建一系列巨噬细胞特异性条件性基因敲除小鼠，极大推动了大量髓系功能基因的鉴定工作；这类基因在感染、自身免疫病、纤维化、肿瘤进展等多种炎症相关疾病中发挥关键作用 [15–19]。同时，将 LysM-Cre 小鼠与携带 loxP 位点的白喉毒素受体（DTR）小鼠配繁，可构建诱导型巨噬细胞清除模型 LysM-Cre/iDTR，用于在小鼠模型中探究内源巨噬细胞在创面修复、纤维化疾病、动脉高血压、血管功能紊乱等生理病理过程中的全身调控功能 [20–23]。

尽管 LysM-Cre 对内源巨噬细胞的基因编辑效率很高，但 LysM 并非巨噬细胞特异性标志物。除单核细胞与成熟巨噬细胞外，多数粒细胞、少量 CD11c 阳性树突状细胞（DC）均可表达 LysM；同时小鼠体内少量非造血细胞（如 Ⅱ 型肺泡上皮细胞）也存在 LysM 表达 [12, 23]。多项髓系特异性 Cre 报告小鼠对比实验显示，脾脏、外周血、骨髓中约 60%~80% 的中性粒细胞呈 LysM 阳性 [8]。对于成熟巨噬细胞亚群，肺泡巨噬细胞、腹腔巨噬细胞中 LysM 阳性比例可达 90%~100%，但脾脏红髓巨噬细胞、脾脏边缘区巨噬细胞仅有 40% 存在 LysM-Cre 重组活性，这也反映出组织驻留巨噬细胞起源具有异质性 [8]。综上，LysM-Cre 小鼠是研究体内髓单核细胞应用最广泛的工具模型。

Csf1r-Cre (MGI:4429470)

CSF1R，又称巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）、CD115，是单核 / 巨噬细胞谱系核心分化因子 CSF1 的受体。该蛋白属于酪氨酸激酶，由原癌基因 c-fms 编码，在小鼠所有单核系细胞（包括单核细胞、巨噬细胞）中均有表达。

在 Csf1r-Cre 品系问世前，科研人员已构建 Csf1r-EGFP 报告小鼠（MacGreen 小鼠），并成功利用该模型追踪多种组织内的内源巨噬细胞 [24]。Csf1r-Cre 工具小鼠于 2010 年培育成功，最初用于探究信号转导与转录激活因子 3（STAT3）在巨噬细胞中的功能 [25]。将 Csf1r-Cre 小鼠与 STAT3flox/flox 小鼠交配，获得巨噬细胞条件性 STAT3 敲除小鼠；该小鼠会自发出现结肠炎，且炎症结肠、盲肠部位形成肿瘤，说明髓系细胞信号通路在小鼠肿瘤发生过程中起到关键作用 [25]。

多个研究团队将 Csf1r-Cre 小鼠与 Rosa26-LSL-YFP 小鼠配繁，构建巨噬细胞报告小鼠，借助该模型解析小鼠胚胎器官发生阶段的巨噬细胞谱系发育规律 [26–28]。一系列谱系示踪实验证实，来源于卵黄囊红髓系祖细胞的卵黄囊巨噬细胞，可分化形成部分高表达 F4/80 的组织驻留巨噬细胞，例如肝脏库普弗细胞、表皮朗格汉斯细胞、小胶质细胞 [27, 28]。

研究人员利用各类 Csf1r 特异性基因敲除小鼠，分别在创面修复、自身免疫性脑炎、乳腺癌小鼠模型中，阐明巨噬细胞相关因子（神经纤毛蛋白 1、刺猬蛋白酰基转移酶、Wnt 家族蛋白 7B（Wnt7B）、血管内皮生长因子受体 1（VEGFR1））的生物学功能 [29–33]。

综上，Csf1r-Cre 小鼠是巨噬细胞发育命运图谱绘制、筛选稳态及炎症状态下巨噬细胞关键调控基因的优质工具。该品系可在肝脏、脾脏、肠道、心脏、肾脏、肌肉等多种组织的巨噬细胞中高效实现基因敲除；但 Csf1r-Cre 靶向特异性较差，树突状细胞、粒细胞、T 淋巴细胞中均能检测到 Cre 介导的基因敲除现象 [25]。

CD11b-Cre (MGI:3577104; 3629092)

CD11b，又称整合素 αM（ITGAM），属于整合素家族分子，可与 CD18 配对形成异二聚体整合素 αMβ2（巨噬细胞 1 抗原，Mac-1）。该分子广泛表达于单核细胞、巨噬细胞、粒细胞与自然杀伤细胞（NK 细胞）。功能上，CD11b 调控白细胞黏附与迁移，是炎症应答过程中的关键分子。

2005 年，费龙等人构建 CD11b-Cre 小鼠品系，旨在实现造血髓系 - 破骨细胞谱系的条件性基因敲除 [34]。该研究将 CD11b-Cre 小鼠与 Z/EG（lacZ/EGFP）双报告小鼠交配，获得 CD11b 报告小鼠，以此验证 Cre 的靶向特异性。结果符合预期：多数腹腔巨噬细胞、骨髓与脾脏中大部分巨噬细胞和粒细胞均可检测到 Cre 重组活性；同时，该报告小鼠骨髓、脾脏祖细胞分化形成的成熟破骨细胞大多呈 EGFP 阳性 [34]。

此后，研究人员将 CD11b-Cre 小鼠与各类 loxP 锚定转基因小鼠交配，用于鉴定髓系关键功能基因。依托该品系构建了大量条件性敲除模型，用以探究小胶质细胞相关分子在多种小鼠疾病中的作用，包括前列腺素 E2（PGE2）受体 EP2、EP4，核因子 κB 激酶抑制蛋白 β 亚基（IKK-β），脑源性神经营养因子（BDNF），颗粒蛋白前体以及超氧化物歧化酶 1（SOD1）；相关疾病模型涵盖阿尔茨海默病、自身免疫性脑炎、痛觉过敏、神经炎症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）与高血压 [35–40]。借助 CD11b-Cre 小鼠，科研人员还阐明了丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 / 内切核糖核酸酶 IRE1α、髓样分化蛋白 88（Myd88）、亨廷顿蛋白、组织蛋白酶 K 在组织巨噬细胞介导的炎症应答、亨廷顿病、骨形成及其他病理进程中的功能 [41–44]。

与其他巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠相比，CD11b-Cre 对支气管肺泡灌洗液（BAL）、腹腔、脾脏、骨髓内巨噬细胞的标记效率偏低，不足 50%[8]。此外，Cre 重组活性不仅存在于单核细胞、巨噬细胞，中性粒细胞与树突状细胞中同样可检出，说明其巨噬细胞靶向特异性较差 [8]。另有文献报道该 Cre 转基因品系稳定性不佳，同窝小鼠之间的基因敲除效率存在明显差异 [8]。

F4/80-Cre (MGI:2429642)

F4/80 又称含表皮生长因子样结构域黏蛋白样激素受体 1（EMR1），在小鼠体内由粘附 G 蛋白偶联受体 E1（ADGRE1）基因编码。F4/80 是一种细胞表面糖蛋白，表达于肝脏库普弗细胞、脾脏红髓巨噬细胞等各类组织驻留巨噬细胞表面 [45]。

F4/80-Cre 小鼠品系构建于 2002 年，研究人员将 Cre 重组酶互补 DNA 插入 F4/80 基因的第一个编码外显子中 [46]。科研人员将该品系分别与携带 loxP 位点的 1 - 磷酸鞘氨醇受体 1（S1PR1）、铁转运蛋白（Fpn1）转基因小鼠交配，明确两种分子在腹膜炎与铁稳态中的功能 [47, 48]。同时，将 F4/80-Cre 小鼠与 Rosa26-LSL-TdTomato 小鼠配繁，可构建报告小鼠，用于观测肺间质巨噬细胞的发育过程 [49]。

研究证实 F4/80-Cre 仅在腹腔巨噬细胞等少数几类组织巨噬细胞中存在重组活性 [8]，因此相较于其他巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠，该品系很少用于构建基因编辑模型。

CX3CR1-Cre(MGI: 5311737;5467983; 5450813;5467985)

CX3C 趋化因子受体 1（CX3CR1），也称为分形趋化因子受体或 G 蛋白偶联受体 13（GPR13），是趋化因子 CX3CL1 的受体，特异性表达于单核吞噬细胞系统。2013 年，两个研究团队报道构建了 Cx3cr1-Cre 与 Cx3cr1-CreER 小鼠，将组成型或他莫昔芬诱导型 Cre 重组酶基因定点插入 Cx3cr1 基因位点 [50, 51]。其中 Cx3cr1-CreER 品系实用性突出，可实现巨噬细胞中转基因敲除 / 激活的时间可控调控。

Cx3cr1-Cre 与 Cx3cr1-CreER 品系主要有三大应用方向。第一，将该类小鼠与 Rosa26-LSL-YFP、Rosa26-LSL-RFP、Rosa26-LSL-GFP、Rosa26-LSL-TdTomato 等荧光报告小鼠交配，可获得报告基因小鼠，用于胚胎发育阶段胎儿单核细胞 / 巨噬细胞的命运图谱绘制，以及稳态下心脏、回肠、结肠、腹腔、肝脏内成年巨噬细胞的谱系示踪 [50, 52–57]。第二，将 Cx3cr1-Cre 或 Cx3cr1-CreER 小鼠与 loxP 锚定转基因小鼠配繁，可构建多种巨噬细胞特异性条件性敲除小鼠。借助这类模型，科研人员深入解析了巨噬细胞相关基因的功能，包括转化生长因子 β 活化激酶 1（TAK1）、泛素特异性蛋白酶 18（Usp18）、跨膜蛋白 16F（TMEM16F）、肿瘤坏死因子 α（TNFα）、光敏感通道蛋白 2（ChR2）；上述基因参与大脑与心脏功能维持，同时介导炎症与自身免疫病发生发展 [58–65]。第三，与 Rosa26-iDTR 小鼠交配后，Cx3cr1-Cre、Cx3cr1-CreER 小鼠可构建巨噬细胞特异性条件性清除模型，注射白喉毒素（DT）即可清除巨噬细胞；该模型清除小鼠小胶质细胞与肠道巨噬细胞的效率很高 [52, 66]。

靶向特异性方面，尽管 Cx3cr1-Cre 基本不会标记中性粒细胞，但除单核细胞、巨噬细胞外，肥大细胞与树突状细胞中也会出现基因敲除现象 [8, 53]。该品系对腹腔巨噬细胞的敲除效率较高，可达 70%~80%；但对支气管肺泡灌洗液巨噬细胞、脾脏巨噬细胞与外周血单核细胞的敲除效率偏低，仅 40%~60%[8]。

总结：

本章主要介绍了目前常用的巨噬细胞靶向 Cre 工具小鼠。除上述品系外，还有部分髓系特异性转基因可靶向特定组织巨噬细胞亚群，相关序列也被用于构建 Cre 转基因小鼠。例如，C 型凝集素 CD207a（朗格汉斯蛋白）仅表达于表皮巨噬细胞（朗格汉斯细胞），科研人员据此构建 CD207a-Cre 小鼠，用于研究小鼠体内天然朗格汉斯细胞 [67, 68]。此外，在探究胚胎早期巨噬细胞发育时，研究人员还使用了多种造血分化基因启动子驱动的 Cre 转基因小鼠，相关基因包括 runt 相关转录因子 1（Runx1）、FMS 样酪氨酸激酶 3（Flt3）等 [28, 69, 70]。

无论生理稳态还是病理状态下，巨噬细胞均是一类高度异质、可塑性极强的髓系细胞群。在胚胎发育、成年组织稳态维持以及各类炎症疾病进程中，巨噬细胞的基因表达模式会发生动态改变。同时，单核 / 巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞谱系亲缘关系相近，各类细胞的基因表达谱存在大量重叠。因此，理论上不存在仅特异性靶向巨噬细胞、无任何脱靶的 Cre 转基因小鼠品系。在利用各类 Cre 工具小鼠开展巨噬细胞相关研究并得出确定性结论前，必须搭配流式细胞术、免疫染色、功能基因组学等其他实验手段进行联合验证。

一、通用广谱髓系 / 巨噬细胞组成型 Cre（无诱导，持续表达 Cre）

1. LysM-Cre（Lyz2-Cre，最常用）

●驱动基因：溶菌酶 M（LysM/Lyz2），成熟单核、巨噬、粒细胞高表达

●靶向细胞：腹腔巨噬、肺泡巨噬、骨髓来源巨噬、中性粒、树突状细胞 DC

●优势：重组效率极高（巨噬细胞 95%~100%）、品系易得、价格低，炎症巨噬靶向稳定

●缺陷：特异性差，中性粒、DC 同步敲除；部分肺上皮、神经细胞存在渗漏；敲除同时内源 LysM 基因失活，影响抗菌功能研究 

●适用：只关注髓系整体、不区分粒细胞 / 巨噬的肿瘤、炎症模型

2. Csf1r-Cre（CD115-Cre）

●驱动基因：巨噬细胞集落刺激因子受体，单核 - 巨噬谱系早期即表达

●靶向：骨髓单核、组织巨噬、破骨细胞；同时标记巨核细胞、部分 T/DC、中性粒

●优势：胚胎期巨噬祖细胞即可标记，适合巨噬发育、卵黄囊起源巨噬示踪

●缺陷：造血广谱渗漏，非巨噬细胞重组严重；成熟组织驻留巨噬效率偏低

●适用：巨噬细胞发育、胚胎组织巨噬起源研究

3. CD11b-Cre（Itgam-Cre）

●驱动基因：整合素 CD11b（Mac-1）

●靶向：单核、巨噬、粒细胞、破骨细胞、NK 细胞

●优势：腹腔、脾脏巨噬重组效率尚可，适合骨相关巨噬 / 破骨细胞实验

●缺陷：巨噬靶向效率不足 50%，同窝小鼠敲除效率不均一；粒细胞大量渗漏

●适用：骨代谢、破骨细胞联合巨噬功能研究

4. F4/80-Cre

●驱动基因：成熟组织巨噬标志性膜蛋白 F4/80

●靶向：腹腔、肝脏 Kupffer、脾脏红髓巨噬；几乎不标记单核、粒细胞

●优势：粒细胞无渗漏，相对更偏向成熟组织巨噬

●缺陷：重组效率极低，仅部分巨噬发生敲除，极少用于基因敲除，多用于示踪对照 

二、诱导型 CreERT2（他莫昔芬给药后才激活，可时间可控，区分单核 / 巨噬）

1. Cx3cr1-CreER（Cx3cr1-CreERT2）

●驱动基因：趋化因子受体 CX3CR1

●靶向：小胶质细胞、间质巨噬、循环单核；中性粒几乎无渗漏

●优势：时间可控，无粒细胞干扰，是脑小胶质细胞金标准；可区分短期单核与长期驻留巨噬

●缺陷：肝脏 Kupffer、肺泡巨噬重组效率极低；肥大细胞、DC 存在少量渗漏 

●适用：神经小胶质、组织间质巨噬、单核细胞谱系示踪

2. hCD68-CreERT2（人源 CD68 启动子诱导型）

●驱动元件：人 CD68 启动子（小鼠内源 CD68 启动子特异性差）

●靶向：腹腔、肝、脾、肺组织驻留巨噬；中性粒、DC、淋巴细胞几乎无渗漏

●优势：现有 Cre 中巨噬特异性最优，诱导后仅靶向成熟组织巨噬，脱靶极少

●缺陷：需连续 5 天他莫昔芬诱导，操作周期长；肺泡巨噬效率一般

●适用：追求高巨噬特异性、排除粒细胞干扰的肿瘤免疫、稳态巨噬研究

三、单一组织驻留巨噬细胞专属 Cre（器官特异性巨噬）

1. Clec4f-Cre / Clec4f-CreERT2专属肝脏 Kupffer 细胞，几乎不标记其他组织巨噬

2. Ctsk-Cre特异性靶向破骨细胞（骨组织巨噬亚型）

3. Sall1-CreER仅脑实质小胶质细胞，不标记脑膜巨噬（BAM）

4. Mrc1-CreER（CD206-CreER）靶向 CD206 阳性 M2 型组织巨噬（肝脏、脾脏、皮下间质巨噬）

四、各品系快速选型总结

1. 常规炎症 / 肿瘤巨噬、预算有限 → LysM-Cre

2. 脑小胶质、单核谱系示踪、不想标记中性粒 → Cx3cr1-CreER

3. 需要高特异性、排除粒细胞 / DC 干扰 → hCD68-CreERT2

4. 胚胎巨噬发育、造血祖细胞研究 → Csf1r-Cre

5. 肝脏库普弗细胞单独研究 → Clec4f-Cre

6. 骨代谢、破骨细胞功能 → CD11b-Cre / Ctsk-Cre

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参考文献

1.Nagy A (2000) Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis 26(2):99–109

2.Heffner CS, Herbert Pratt C, Babiuk RP et al (2012) Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications 3:1218. https://doi.org/10.1038/ncomms2186

3.Kuhn R, Torres RM (2002) Cre/loxP recombination system and gene targeting. Methods in Molecular Biology 180:175–204. https://doi.org/10.1385/1-59259-178-7:175

4.Kwan KM (2002) Conditional alleles in mice: practical considerations for tissue-specific knockouts. Genesis 32(2):49–62

5.Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH et al (1998) Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology 8(24):1323–1326

6.Srinivas S, Watanabe T, Lin CS et al (2001) Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology 1:4

7.Buch T, Heppner FL, Tertilt C et al (2005) A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration. Nature Methods 2(6):419–426. https://doi.org/10.1038/nmeth762

8.Abram CL, Roberge GL, Hu Y et al (2014) Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. Journal of Immunological Methods 408:89–100. https://doi.org/10.1016/j.jim.2014.05.009

9.Short ML, Nickel J, Schmitz A et al (1996) Lysozyme gene expression and regulation. Experientia Supplementum 75:243–257

10Cross M, Renkawitz R (1990) Repetitive sequence involvement in the duplication and divergence of mouse lysozyme genes. The EMBO Journal 9(4):1283–1288

11.Clausen BE, Burkhardt C, Reith W et al (1999) Conditional gene targeting in macrophages and granulocytes using LysMcre mice. Transgenic Research 8(4):265–277

12.Faust N, Varas F, Kelly LM et al (2000) Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood 96(2):719–726

13.Ganz T, Gabayan V, Liao HI et al (2003) Increased inflammation in lysozyme M-deficient mice in response to Micrococcus luteus and its peptidoglycan. Blood 101(6):2388–2392. https://doi.org/10.1182/blood-2002-07-2319

14.Ye M, Iwasaki H, Laiosa CV et al (2003) Hematopoietic stem cells expressing the myeloid lysozyme gene retain long-term, multilineage repopulation potential. Immunity 19(5):689–699

15.Yasukawa H, Ohishi M, Mori H et al (2003) IL-6 induces an anti-inflammatory response in the absence of SOCS3 in macrophages. Nature Immunology 4(6):551–556. https://doi.org/10.1038/ni938

16.Herbert DR, Holscher C, Mohrs M et al (2004) Alternative macrophage activation is essential for survival during schistosomiasis and downmodulates T helper 1 responses and immunopathology. Immunity 20(5):623–635

17.Vannella KM, Barron L, Borthwick LA et al (2014) Incomplete deletion of IL-4Rα by LysM(Cre) reveals distinct subsets of M2 macrophages controlling inflammation and fibrosis in chronic schistosomiasis. PLOS Pathogens 10(9):e1004372. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004372

18.Greten FR, Eckmann L, Greten TF et al (2004) IKKβ links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell 118(3):285–296. https://doi.org/10.1016/j.cell.2004.07.013

19.Kanter JE, Kramer F, Barnhart S et al (2012) Diabetes promotes an inflammatory macrophage phenotype and atherosclerosis through acyl-CoA synthetase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(12):E715–E724. https://doi.org/10.1073/pnas.1111600109

20.Goren I, Allmann N, Yogev N et al (2009) A transgenic mouse model of inducible macrophage depletion: effects of diphtheria toxin-driven lysozyme M-specific cell lineage ablation on wound inflammatory, angiogenic, and contractive processes. The American Journal of Pathology 175(1):132–147. https://doi.org/10.2353/ajpath.2009.081002

21.Lucas T, Waisman A, Ranjan R et al (2010) Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. Journal of Immunology 184(7):3964–3977. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0903356

22.Meng XM, Wang S, Huang XR et al (2016) Inflammatory macrophages can transdifferentiate into myofibroblasts during renal fibrosis. Cell Death & Disease 7(12):e2495. https://doi.org/10.1038/cddis.2016.402

23.Miyake Y, Kaise H, Isono K et al (2007) Protective role of macrophages in noninflammatory lung injury caused by selective ablation of alveolar epithelial type II Cells. Journal of Immunology 178(8):5001–5009

24.Sasmono RT, Oceandy D, Pollard JW et al (2003) A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood 101(3):1155–1163. https://doi.org/10.1182/blood-2002-02-0569

25.Deng L, Zhou JF, Sellers RS et al (2010) A novel mouse model of inflammatory bowel disease links mammalian target of rapamycin-dependent hyperproliferation of colonic epithelium to inflammation-associated tumorigenesis. The American Journal of Pathology 176(2):952–967. https://doi.org/10.2353/ajpath.2010.090622

26.Mass E, Ballesteros I, Farlik M et al (2016) Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. Science 353(6304):aaf4238. https://doi.org/10.1126/science.aaf4238

27.Schulz C, Gomez Perdiguero E, Chorro L et al (2012) A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science 336(6077):86–90. https://doi.org/10.1126/science.1219179

28.Gomez Perdiguero E, Klapproth K, Schulz C et al (2015) Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature 518(7540):547–551. https://doi.org/10.1038/nature13989

29.Lin SL, Li B, Rao S et al (2010) Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107(9):4194–4199. https://doi.org/10.1073/pnas.0912228107

30.Nissen JC, Tsirka SE (2016) Tuftsin-driven experimental autoimmune encephalomyelitis recovery requires neuropilin-1. Glia 64(6):923–936. https://doi.org/10.1002/glia.22972

31.Saha S, Aranda E, Hayakawa Y et al (2016) Macrophage-derived extracellular vesicle-packaged WNTs rescue intestinal stem cells and enhance survival after radiation injury. Nature Communications 7:13096. https://doi.org/10.1038/ncomms13096

32.Stefater JA 3rd, Rao S, Bezold K et al (2013) Macrophage Wnt-Calcineurin-Flt1 signaling regulates mouse wound angiogenesis and repair. Blood 121(13):2574–2578. https://doi.org/10.1182/blood-2012-06-434621

33.Yeo EJ, Cassetta L, Qian BZ et al (2014) Myeloid WNT7b mediates the angiogenic switch and metastasis in breast cancer. Cancer Research 74(11):2962–2973. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-13-2421

34.Ferron M, Vacher J (2005) Targeted expression of Cre recombinase in macrophages and osteoclasts in transgenic mice. Genesis 41(3):138–145. https://doi.org/10.1002/gene.20108

35.Boillee S, Yamanaka K, Lobsiger CS et al (2006) Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science 312(5778):1389–1392. https://doi.org/10.1126/science.1123511

36.Evangelidou M, Karamita M, Vamvakas SS et al (2014) Altered expression of oligodendrocyte and neuronal marker genes predicts the clinical onset of autoimmune encephalomyelitis and indicates the effectiveness of multiple sclerosis-directed therapeutics. Journal of Immunology 192(9):4122–4133. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1300633

37.Ferrini F, Trang T, Mattioli TA et al (2013) Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl⁻ homeostasis. Nature Neuroscience 16(2):183–192. https://doi.org/10.1038/nn.3295

38.Johansson JU, Woodling NS, Wang Q et al (2015) Prostaglandin signaling suppresses beneficial microglial function in Alzheimer's disease models. The Journal of Clinical Investigation 125(1):350–364. https://doi.org/10.1172/JCI77487

39.Zhang MZ, Yao B, Wang Y et al (2015) Inhibition of cyclooxygenase-2 in hematopoietic cells results in salt-sensitive hypertension. The Journal of Clinical Investigation 125(11):4281–4294. https://doi.org/10.1172/JCI81550

40.Martens LH, Zhang J, Barmada SJ et al (2012) Progranulin deficiency promotes neuroinflammation and neuron loss following toxin-induced injury. The Journal of Clinical Investigation 122(11):3955–3959. https://doi.org/10.1172/JCI63113

41.Kwan W, Trager U, Davalos D et al (2012) Mutant huntingtin impairs immune cell migration in Huntington disease. The Journal of Clinical Investigation 122(12):4737–4747. https://doi.org/10.1172/JCI64484

42.Robblee MM, Kim CC, Porter Abate J et al (2016) Saturated fatty acids engage an IRE1α-dependent pathway to activate the NLRP3 inflammasome in myeloid cells. Cell Reports 14(11):2611–2623. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.02.053

43.Sugatani T, Hruska KA (2009) Impaired micro-RNA pathways diminish osteoclast differentiation and function. The Journal of Biological Chemistry 284(7):4667–4678. https://doi.org/10.1074/jbc.M805777200

44.Yu M, Zhou H, Zhao J et al (2014) MyD88-dependent interplay between myeloid and endothelial cells in the initiation and progression of obesity-associated inflammatory diseases. The Journal of Experimental Medicine 211(5):887–907. https://doi.org/10.1084/jem.20131314

45.Davies LC, Jenkins SJ, Allen JE et al (2013) Tissue-resident macrophages. Nature Immunology 14(10):986–995. https://doi.org/10.1038/ni.2705

46.Schaller E, Macfarlane AJ, Rupec RA et al (2002) Inactivation of the F4/80 glycoprotein in the mouse germ line. Molecular and Cellular Biology 22(22):8035–8043

47.Weichand B, Weis N, Weigert A et al (2013) Apoptotic cells enhance sphingosine-1-phosphate receptor 1 dependent macrophage migration. European Journal of Immunology 43(12):3306–3313. https://doi.org/10.1002/eji.201343441

48.Zhang Z, Zhang F, An P et al (2011) Ferroportin1 deficiency in mouse macrophages impairs iron homeostasis and inflammatory responses. Blood 118(7):1912–1922. https://doi.org/10.1182/blood-2011-01-330324

49.Tan SY, Krasnow MA (2016) Developmental origin of lung macrophage diversity. Development 143(8):1318–1327. https://doi.org/10.1242/dev.129122

50.Yona S, Kim KW, Wolf Y et al (2013) Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity 38(1):79–91. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2012.12.001

51.Parkhurst CN, Yang G, Ninan I et al (2013) Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell 155(7):1596–1609. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.11.030

52.Aychek T, Mildner A, Yona S et al (2015) IL-23-mediated mononuclear phagocyte crosstalk protects mice from Citrobacter rodentium-induced colon immunopathology. Nature Communications 6:6525. https://doi.org/10.1038/ncomms7525

53.Cain DW, O’Koren EG, Kan MJ et al (2013) Identification of a tissue-specific, C/EBPβ-dependent pathway of differentiation for murine peritoneal macrophages. Journal of Immunology 191(9):4665–4675. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1300581

54.Kim KW, Williams JW, Wang YT et al (2016) MHC II⁺ resident peritoneal and pleural macrophages rely on IRF4 for development from circulating monocytes. The Journal of Experimental Medicine 213(10):1951–1959. https://doi.org/10.1084/jem.20160486

55.Molawi K, Wolf Y, Kandalla PK et al (2014) Progressive replacement of embryo-derived cardiac macrophages with age. The Journal of Experimental Medicine 211(11):2151–2158. https://doi.org/10.1084/jem.20140639

56.Theurl I, Hilgendorf I, Nairz M et al (2016) On-demand erythrocyte disposal and iron recycling requires transient macrophages in the liver. Nature Medicine 22(8):945–951. https://doi.org/10.1038/nm.4146

57.DeFalco T, Bhattacharya I, Williams AV et al (2014) Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(23):E2384–E2393. https://doi.org/10.1073/pnas.1400057111

58.Batti L, Sundukova M, Murana E et al (2016) TMEM16F regulates spinal microglial function in neuropathic pain states. Cell Reports 15(12):2608–2615. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.05.039

59.Goldmann T, Wieghofer P, Muller PF et al (2013) A new type of microglia gene targeting shows TAK1 to be pivotal in CNS autoimmune inflammation. Nature Neuroscience 16(11):1618–1626. https://doi.org/10.1038/nn.3531

60.Goldmann T, Zeller N, Raasch J et al (2015) USP18 lack in microglia causes destructive interferonopathy of the mouse brain. The EMBO Journal 34(12):1612–1629. https://doi.org/10.15252/embj.201490791

61.Lewitus GM, Konefal SC, Greenhalgh AD et al (2016) Microglial TNF-α suppresses cocaine-induced plasticity and behavioral sensitization. Neuron 90(3):483–491. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.03.030

62.Li D, Wang C, Yao Y et al (2016) mTORC1 pathway disruption ameliorates brain inflammation following stroke via a shift in microglia phenotype from M1 type to M2 type. The FASEB Journal 30(10):3388–3399. https://doi.org/10.1096/fj.201600495R

63.Wolf Y, Shemer A, Polonsky M et al (2017) Autonomous TNF is critical for in vivo monocyte survival in steady state and inflammation. The Journal of Experimental Medicine 214(4):905–917. https://doi.org/10.1084/jem.20160499

64.Hulsmans M, Clauss S, Xiao L et al (2017) Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell 169(3):510–522.e20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.03.050

65.Gao H, Danzi MC, Choi CS et al (2017) Opposing functions of microglial and macrophagic TNFR2 in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. Cell Reports 18(1):198–212. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.11.083

66.Peng J, Gu N, Zhou L et al (2016) Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communications 7:12029. https://doi.org/10.1038/ncomms12029

67.Kaplan DH, Li MO, Jenison MC et al (2007) Autocrine/paracrine TGFβ1 is required for the development of epidermal Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine 204(11):2545–2552. https://doi.org/10.1084/jem.20071401

68.Zahner SP, Kel JM, Martina CA et al (2011) Conditional deletion of TGF-βR1 using Langerin-Cre mice results in Langerhans cell deficiency and reduced contact hypersensitivity. Journal of Immunology 187(10):5069–5076. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1101880

69.Samokhvalov IM, Samokhvalova NI, Nishikawa S (2007) Cell tracing shows the contribution of the yolk sac to adult haematopoiesis. Nature 446(7139):1056–1061. https://doi.org/10.1038/nature05725

70.Boiers C, Carrelha J, Lutteropp M et al (2013) Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell 13(5):535–548. https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.08.012