研究巨噬细胞功能时，通过回输(Transfer)特定修饰或来源特定的目的巨噬细胞到受体小鼠，是体内研究巨噬细胞功能的经典实验策略。其核心在于精确控制巨噬细胞清除与回输的时间窗口，确保原位巨噬细胞被有效清除，而回输的细胞能存活并发挥功能。鉴于回输实验比较难做，回输细胞的数量，活率，纯度以及功能性活性都决定了Transfer实验的成功与否。
概要
巨噬细胞是一类固有免疫细胞，在机体应对感染或组织损伤的炎症反应中发挥重要作用，同时在炎症消退过程中同样具有关键功能。巨噬细胞主导调控固有免疫应答及后续适应性免疫应答。为行使各类生理功能，巨噬细胞可根据局部微环境变化，分化形成多种特征各异但功能存在重叠的活化状态。干扰素γ(IFNγ)、脂多糖(LPS)等刺激因子可诱导巨噬细胞发生促炎活化，伴随活性氧、促炎细胞因子及趋化因子的生成。免疫复合物与脂多糖可诱导巨噬细胞进入抗炎活化状态，避免机体组织受到损伤；该状态下细胞高表达抗炎细胞因子IL-10，同时低表达促炎细胞因子。创伤修复型巨噬细胞可被IL-4或IL-13激活，参与组织重塑与炎症消退过程。巨噬细胞几乎分布于机体所有组织中，对维持机体稳态至关重要；而巨噬细胞功能异常也会诱发炎症性肠病等各类疾病。为研究巨噬细胞在复杂体内环境中的作用，一个经常采用的实验模型就是巨噬细胞清除与重建（Depletion and Reconstitution）。氯膦酸脂质体是体内清除巨噬细胞高效且通用的工具，可靶向特异性清除目标组织中的巨噬细胞，也可应用于转基因小鼠实验。但氯膦酸脂质体会无差别清除所有亚型巨噬细胞及某些病理状态下的激活树突状细胞，因此需要联合其他实验策略，以明确生理效应是由整体巨噬细胞还是特定活化表型的巨噬细胞所介导。可通过过继转移/回输（Transfer）方式重建巨噬细胞，无论是否预先清除内源巨噬细胞，均可进一步验证所观测的生物学效应是否依赖巨噬细胞。将体外活化的巨噬细胞或转基因小鼠来源的巨噬细胞过继转移至疾病模型中，可探究特定蛋白分子或活化状态是否影响疾病进程。研究证实：联合使用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞与巨噬细胞重建实验，能够有效解析巨噬细胞在生理稳态及疾病发生发展中的作用。
流程
氯膦酸二钠脂质体介导小鼠巨噬细胞特异性耗竭与回输重建的实验流程。氯膦酸二钠脂质体注射方式可以是眼眶后静脉，也可以是尾静脉。两者几乎可以等效。只不过尾静脉更为常用。以BMDM制备来回输最为常见。
要点
一、实验设计和分组
耗竭窗口期必须精准
氯膦酸盐脂质体腹腔 / 尾静脉注射后，巨噬细胞耗竭高峰期 2–4 天，回输一般在耗竭后第2–5 天进行；间隔太久，小鼠自身源自骨髓的单核细胞会自发重建，实验失效。
小鼠品系、周龄、性别统一
常用 C57BL/6，6–8 周龄，雌雄分开
分组必须齐全（非常重要）
空白对照组（不耗竭 + 不回输）单纯耗竭组（氯膦酸 + 不回输）回输重建组（氯膦酸 + 巨噬细胞回输），首次实验，回输的细胞做梯度空脂质体对照组（排除脂质体本身毒性）
二、巨噬细胞制备关键点（原代骨髓 / 腹腔巨噬细胞等源头的WT小鼠或者基因修饰小鼠）
细胞纯度
骨髓来源巨噬细胞 BMDM：诱导分化后纯度＞90%；腹腔巨噬细胞需预刺激富集，避免杂细胞。
细胞活率
活率＞95%，无支原体、无细菌污染，冰上操作、全程低温。侧重于细胞数量。细胞活性相对于活率，活性侧重于细胞质量。活性与细胞的代谢状态、增殖能力，分泌功能等功能性指标关联。
细胞重悬溶剂
用无菌 PBS 或生理盐水，不含血清，防止输注后过敏、肺部栓塞。
回输剂量
一般注射体积为200ul，细胞数量为2*10^5~2*10^7，可参考原位巨噬细胞数量做梯度。
三、回输操作核心注意事项（尾静脉为主）
注射方式优先尾静脉
尾静脉回输：细胞可进入循环、组织定植重建；腹腔回输主要定植腹腔，全身重建效果弱。
推注速度
缓慢匀速，100–200 μL / 只，1–2 min 推完，过快易造成肺栓塞、小鼠猝死。
避免气泡
注射器内绝对不能有气泡，否则会引发空气栓塞直接死亡。
四、术后观察与验证
24 h 内重点观察
呼吸、活动、皮毛，防止急性肺损伤 / 过敏死亡。
重建效率验证（必做）
回输后 3、7、14 天取外周血，脾、肝、肺、肠道，流式F4/80等Marker多标检测巨噬细胞比例，此外，利用CD45.1和CD45.2基因位点确认重建成功。
炎症模型时间匹配
结肠炎、肿瘤模型，回输后 2–3 天造模，保证巨噬细胞功能稳定。除了造模前回输，也可以疾病模型进程中回输，根据实验目的灵活回输。
五、常见踩坑点
耗竭时间不对 → 自身细胞先恢复，回输无差异细胞浓度太高、推注太快 → 小鼠批量死亡用含血清培养基回输 → 急性免疫反应缺少空脂质体对照 → 结果无法排除脂质体毒性未流式验证重建效率 → 文章审稿人质疑。
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